이 작품은 파리의 도시, 아니 프랑스 국립 부여 ANR - 09 - JCJC - 0118-1, 그리고 ERC 시작 부여 RNAvirusPopDivNVax 프로젝트에서 의료 및 건강 연구 부여에서 기금에 의해 지원되었다. 242719.

<ol>
	<li>Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA-dependent+RNA+polymerase+(in)fidelity+revealed+by+kinetic+analysis+of+the+polymerase+encoded+by+a+foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+reduced+sensitivity+to+ribavirin.">Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin.</a> J Virol. 82, 12346-12355 (2008).</li><li>Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+site+control+of+an+active+site+fidelity+checkpoint+in+a+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase.">Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase.</a> J Biol Chem. 280, 25706-25716 (2005).</li><li>Korneeva, V. S., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+of+the+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase:+fidelity,+replication+speed,+and+initiation+mechanism+determined+by+a+residue+in+the+ribose-binding+pocket.">Structure-function relationships of the viral RNA-dependent RNA polymerase: fidelity, replication speed, and initiation mechanism determined by a residue in the ribose-binding pocket.</a> J Biol Chem. 282, 16135-16145 (2007).</li><li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+mutation+in+poliovirus+RNA-dependent+RNA+polymerase+confers+resistance+to+mutagenic+nucleotide+analogs+via+increased+fidelity.">A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).</li><li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+fidelity+reduces+poliovirus+fitness+and+virulence+under+selective+pressure+in+mice.">Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice.</a> PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).</li><li>Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasispecies+diversity+determines+pathogenesis+through+cooperative+interactions+in+a+viral+population.">Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population.</a> Nature. 439, 344-348 (2006).</li><li>Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+attenuated+virus+vaccines+by+controlling+replication+fidelity.">Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity.</a> Nat Med. 14, 154-161 (2008).</li><li>Crotty, S., Cameron, C., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribavirin's+antiviral+mechanism+of+action:+lethal+mutagenesis.">Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis.</a> J Mol Med. 80, 86-95 (2002).</li><li>Coffey, L. L., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+alternation+of+chikungunya+virus+increases+fitness+while+restricting+population+diversity+and+adaptability+to+novel+selective+pressures.">Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures.</a> J Virol. 85, 1025-1035 (2011).</li><li>Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+mutant+spectrum+in+adaptation+and+replication+of+West+Nile+virus.">Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).</li><li>Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+ribavirin+antiviral+efficacy+via+nucleoside+transporter-mediated+drug+resistance.">Reduced ribavirin antiviral efficacy via nucleoside transporter-mediated drug resistance.</a> J Virol. 83, 4538-4547 (2009).</li><li>Levi, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fidelity+variants+of+RNA+dependent+RNA+polymerases+uncover+an+indirect,+mutagenic+activity+of+amiloride+compounds.">Fidelity variants of RNA dependent RNA polymerases uncover an indirect, mutagenic activity of amiloride compounds.</a> PLoS Pathog. 6, e1001163-e1001163 (2010).</li><li>Sierra, S., D&#225;vila, M., Lowenstein, P. R., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+foot-and-mouth+disease+virus+to+increased+mutagenesis:+influence+of+viral+load+and+fitness+in+loss+of+infectivity.">Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity.</a> J Virol. 74, 8316-8323 (2000).</li><li>Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethal+mutagenesis+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus+(LCMV).">Lethal mutagenesis of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV).</a> Virology. 308, 37-47 (2003).</li><li>Sierra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+decreased+sensitivity+to+ribavirin:+implications+for+error+catastrophe.">Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe.</a> J Virol. 81, 2012-2024 (2007).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

세포주의 선택. RNA mutagens과 같은 기본 analogs의 효능은 다른 세포 유형 11 그들의 상대적인 이해와 연결합니다. 일반적으로 바이러스 통로에 사용되는 셀 라인이 이해하거나 너무 민감한 (높은 세포 독성)을 mutagen에 내화물로 증명한다면, 이러한 요구 사항을 충족하면서 바이러스 복제 허용하는 다른 세포주를 사용해야 할 수도 있습니다. mutagen 저항 변형이 고립되면 특성의 나머지 부분은 원래, 선호하는 세포주에서 수행할 수 있습니다. 우리의 경험에서 헬라 세포는 쉽게 mutagen을 차지, BHK 세포는 mutagen의 이해에 내화물 아르 10 배 높은 농도와 베로 세포까지 필요합니다. mutagen 이상의 한 종류를 사용하는 경우 mutagen.의 선택은 mutagen 처리, 성공의 가능성에 의해 충실도 변종을 분리하려고 증가합니다. 잘못 복제하는 동안 genomes에 통합됩니다 다양한 구조의 기본 아날로그 mutagens은 주로 후속 복제주기의 변이의 특정 하위 집합의 결과를 유도합니다 ribavirin 치료는 GtoA 및 CtoU 전환 변이 12 호의, 5 azacytidine는 비슷한 편견을 가지고, 함께 CtoG 및 GtoC transversions 13 또한, 5 fluorouracil 우선적으로 AtoG 및 UtoC 전환 유도 14. 또는, MG 2 + 또는 MN이 높은 농도는 + 12 위에서 설명한 바이어스없이 RNA 바이러스의 전반적인 돌연변이의 빈도를 증가시키기 위해 매체를 보충하실 수 있습니다. 바이러스 &#39;코돈 시퀀스에 따라, 그리고 충실도 변종을 생성하는 데 필요한 코돈의 변화, 이러한 조건 중 일부는 다른 이상이 변종의 출현을 선호합니다. 코돈 사이트에서 필요한 AtoG 전이는 주로이 ribavirin에 의해 생성되는 돌연변이로 통신을하기 때문에 높은 충실도 poliovirus G64S 및 콕새키 바이러스 A372V 들어, ribavirin 치료는 가장 쉽게 변종을 위해 선택했습니다. 뫄 대 인구의 크기. 바이러스학에서 조직 문화 감염에 대한 프로토콜을 위해 (높은 뫄) 결함이 방해 입자 (낮은 뫄)의 축적을 방지하거나 바이러스 사이의 재조합을 촉진하기 위해, 감염의 다중성 (뫄)에 특히주의 예. passaging 시리얼 이상 출현 이벤트에 대한 선택하려면, 바이러스 인구 크기를 고려하는 것도 중요합니다. 내성 돌연변이 처음 낮은 주파수에 존재하므로, 각 통로에서 이러한 새로운 변종을 잃지 않도록 다음 (10 5 -10 6 바이러스, 예) 한 구절에서와 같은 대규모 인구 크기 최대한을 전송하는 것이 좋습니다. 물론이나 플라스크의 크기 (감염된 세포의 수를) 최대 배율 것은이 우려하는 경우 뫄의 증가를 최소화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 반면에, mutagen에 대한 바이러스의 감도가 테스트되고있는 실험을 위해, 낮은 뫄 감염을 통해 높은 피트니스 genomes에 의해 실험에서 발생하는 복제 사이클의 수를 증가하고 mutagenized genomes의 구조를 방지하기 위해 수행됩니다 공동 감염 세포 complementation. 복제의 첫 라운드 동안 자손의 genomes에서 발생하는 돌연변이가 즉시 감지되지 않습니다 때문에 이것은 중요합니다. 이러한 mutagenized RNAS의 대부분은 여전히​​ virion로 포장됩니다. 그것이 genomes에있는 치명적인 돌연변이가 중단 복제주기의 결과, 및 바이러스 titer 감소됩니다 감염의 다음 라운드에 있습니다. 그것은 치명적인 돌연변이 유발에 큰 영향을 관찰하기 전에 변이의 축적 여러 라운드를 허용해야 할 수도 있습니다. 마지막으로, mutagen의 존재에있는 통로 시리즈 이상, 바이러스 titers가 멸종 때까지 드롭 계속하면, 연구자는 점차 mutagen (매우 낮은 농도에서 시작)의 양의 증가에 바이러스를 passaging 시도해야합니다. 절연 및 RNA mutagen 모성 인구에서 RNA mutagen 저항력 클론을 생성. RNA의 mutagens는 각 염색체에 여러 무작위 변이를 소개하지만, 저항에 대한 선택은 저항 변이를 풍성하게 (그리고 합의 순서로 수정)합니다. 이 변이를 확인하기 위해, 우리 시퀀스 mutagen 모성 인구 (인구의 합의)이 아닌 개별 바이러스. 따라서 mutagen에 의해 만들어진 하나의 무작위 돌연변이가 순서대로 발견되지 않고 다음과 같은 선정 합의의 변화에​​ 결과가 발견되는 유일한 변이. 우리의 경험에서 우리는 하나 또는 두 개의 같은 합의 순서 변경을 식별합니다. mutagen 모성 인구가 취득되고 저항 변이가 확인되면,이 변종보다 순수한 주식을 생성하는 것이 필요합니다. 위, 우리는 상패 정화 절차를 설명했다. 또는 관심있는 바이러스가 쉽게 식별할 수 plaques를 생성하지 않는 경우, 원하는 변종 purif 수 있습니다희석을 제한함으로써 지휘를 맡는​​. 이러한 접근 방식은 기본적으로 바이러스 재고가 우물의 50 % 미만이 감염되는 등 희석 수 있습니다 96 - 웰 형식의 TCID 50입니다. 이 희석을 사용하여, 상기와 같은 방법 10 개인 변종까지 분리하고 그들의 순서를 확인한에 찍은 것입니다. 언급했듯이, 가장 좋은 경우에, 바이러스 스트레인의 감염성 cDNA 클론이 가능합니다. 변종의 격리 따라서 필요 없을 것입니다. 우리의 경험에서 충실도 변종은 하나의 아미노산 대체의 결과이며, 따라서 같은 Quikchange (애질런트)와 같은 간단한 상용 돌연변이 유발 키트를 사용하여 생성할 수 있습니다. 이차 옵션은 밀접하게 관련 변형의 cDNA 클론을 사용하는 것입니다. 관련 변형을 사용하는 경우에는, 우리는 강력하게 우리가 두 밀접한 관련이 바이러스에 동일한 성실 변경 돌연변이 반드시 동일한 효과를 가지고되지 않습니다 찾을 수 있기 때문에 이러한 접근 방식 및 바이러스 분리 (예 : 상패 정화)를 모두 사용하는 것이 좋습니다. 성심과 RNA mutagen 강한 변종의 복제. 선택은 그들의 야생 유형 매쉬 4,12,15과 유사한 성장 특성 모두 높은 낮은 충실도 변종의 격리 결과있다. 현재, 효소 활동 속도와 성실 사이의 링크는 완전히 이해되지 않습니다. 낮은 충실도 변종 빠르게 처리 1-3,12을하는 경향이있는 동안 체외에서 정화 RNA 효소를 사용하여 생화학 연구, 높은 충실도 변종 느린 처리 속도를 가지고 것으로 나타났습니다. 조직 문화에서 이러한 차이는 속도 - 제한 단계, 그 자원의 가용성,보다 본질적인 효소 활동 속도론을 제안, 보통 분명하지 않습니다. 충실도 변종이 야생 유형에서 크게 다르지 않아, 속도론과 복제한다면, 자신의 돌연변이 주파수의 비교 직접 만들 수 있습니다. 복제 속도론에 매우 중요한 변경이있는 경우 다음 데이터 복제 사이클의 동일한 숫자를받은 바이러스를 비교하여 예를 들어 운동의 차이에 대한 계정을 정상화해야합니다. 한 단계 성장 속도론에 큰 차이가 야생 유형과 높은 충실도 변종 사이에 관찰된도했지만 우리의 경험에서, (안에 우리는 높은 충실도의 변종이 지속적으로 야생 유형에 비해 (1 로그 이내) 높은 titer 것을 관찰 그러나 그들은 약간 덜 RNA를 크기의 순서대로)은 더 이상 그들이 생산 genomes 적은 수의 변이를 포함하는보다 전염성 따라서는 것을 몰랐다. 샘플 준비 및 시퀀싱이. 이러한 프로토콜의 모든 단계를 위해, 그것은 그들이 생물학 관련 돌연변이 구별되지 않을 수 있기 때문에 높은 충실도, 증명 - 독서 효소가 추가 변이를 도입 제한 PCR 및 RT - PCR에 사용되는 필수적입니다. 그것은 비교하는 바이러스 인구가 충분한부터 자료가 있다고 확인하는 것도 중요합니다 같은 조건 (통과 기록, 조직 문화 매체, 온도, RNA 추출 방법, RT - PCR 프로토콜 등)에 준비되었습니다 것이 중요합니다 강한 밴드가 RT - PCR에 의해 생성된 이러한 RNA 추출에서 얻은. RNA 샘플의 100분의 1 희석도 샘플 (반복적으로 동일한 게놈을 확장) 표현의 선입견을 피하기 위해 RNA 분자의 충분한 숫자를 포함되었음을 나타내는 감지 RT - PCR 밴드를 제공한다. 돌연변이 주파수 분포이기 때문에, 하나는 유사한 값이 상기 바이어스가 발생하지 않습니다 제공에 관계없이 인구의 크기를 얻을 수있을 것으로 기대합니다. 그림 6 보여주는 마찬가지로 바이러스 주식의 10 5 배 희석은 부모의 혈통이 크게 다르지 않다 돌연변이 주파수를 제공합니다. TopoTA 복제를위한 최적의 조건이 발견되기 전까지는, 시퀀싱 전에 식민지 PCR에 의해, 백색 / 블루 심사 후 삽입의 존재를 확인합니다. mutational 소음 (RT - PCR 및 시퀀싱에 의해 도입 돌연변이)에 대한 제어로서, (가 바이러스 게놈에 해당하는 체외 베꼈는데 RNA의 플라스미드 베어링 같은 바이러스 시퀀스 및 / 또는 복제 및 시퀀스 RT - PCR 제품에서 PCR 제품을 복제 시험 관내 전사 효소에서 다른 것을 알고)는 다른 오류 요금을하고 프로 시저에서 실제 배경 오류와 같은 유용한 정보를 제공하지 않을 수 있습니다. 일부 바이러스 시퀀스는 박테리아에 독성 수 있으므로 그것은 돌연변이 주파수에 대해 합성되는 바이러스 게놈의 지역에 결정하기 전에 이것을 확인하는 것이 중요합니다. TopoTA 얻은 시퀀스를 분석, 각 클론 단 하나의 삽입 / 순서를 포함해야합니다. 더블 피크가 혼합 인구를 제안, 관찰 경우, 두 개의 인접한 박테리아 식민지가 선택되었습니다 수도 있습니다. 정말 어처구니가 돌연변이 박테리아 문화에 플라스미드의 증폭 동안 도입된 것을, 박테리아 복제의 낮은 돌연변이 주파수를 제공하지만 그것은 또한 가능합니다. 플라크의 P에서인구 urified, 더블 피크는 새로운 돌연변을 획득하거나 상패 개발 중에 돌연변을 되돌린 것입니다 중복 plaques, 또는 바이러스를 나타내는 수 있습니다. 일치와 카운트 없거나 이러한 변이를 계산할지 여부를 결정합니다. 마지막으로, 여기에 사용되는 변이의 주파수는 상대적인 가치는 것을 명심하십시오. 그들은 동일한 조건 하에서 재배 바이러스 인구를 비교에 유효하고, 같은 지역을 통해 합성 있습니다! 그들은 돌연변이 속도, 또는 전체 게놈의 돌연변이 빈도의 절대 가치로 이동해서는 안됩니다. 단, 조건이 통제하는 경우, 그들은 돌연변이 분포 및 주파수의 차이의 재현성, 양적 비교를 허용 않습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> ribavirin </td><td> 시그마 </td><td> R9644 - 10MG </td><td></td></tr><tr><td> 5 - fluorouracil </td><td> 시그마 </td><td> F6627 - 1G </td><td></td></tr><tr><td> 5 azacytidine </td><td> 시그마 </td><td> A2385 - 100MG </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 시그마 </td><td> M1028 - 100ML </td><td></td></tr><tr><td> MnCl 2 </td><td> 시그마 </td><td> M1787 </td><td></td></tr><tr><td> Trypan 파랑 </td><td> 시그마 </td><td> T8154 - 20ML </td><td></td></tr><tr><td> TopoTA 복제 키트 </td><td> Invitrogen </td><td> 10351021 </td><td></td></tr><tr><td> Quikchange 돌연변이 유발 키트 </td><td> 애질런트 </td><td> 200516 </td><td> cDNA 전염성 복제 사용할 경우 </td></tr><tr><td> 96 - 웰 miniprep 키트 </td><td> Macherey - 나겔 </td><td> 740625 </td><td></td></tr><tr><td> Lasergene, Sequencher </td><td> DNAstar, 진 코드 주식 회사 </td><td> <a href="www.dnastar.com">www.dnastar.com</a> <a href="www.genecodes.com">www.genecodes.com</a> </td><td> 또는 기타 정렬 소프트웨어 </td></tr></tbody></table>

isolation of fidelity variants of rna viruses and characterization of virus mutation frequency

RNA 바이러스들은 genomes을 복제하는 RNA 의존 RNA의 polymerases를 사용합니다. 이 효소의 본질적으로 높은 오류 비율은 바이러스 적응과 진화를 용이하게 극단적인 인구 다양성의 생성에 큰 기여입니다. 증거를 증가하면 고유 오차 속도와 RNA 바이러스의 돌연변이 결과로 주파수가 바이러스 효소에 미묘한 아미노산의 변화에​​ 의해 변조된 수있다는 것을 보여줍니다. 생화학 assays는 법인 성실의 양적 측정을 허용 몇 가지 바이러스성 RNA의 polymerases을 위해 존재하지만, 우리가 충실도 변경 변이를 식별 생화 학적 접근처럼 정확하게 입증되었습니다 RNA 바이러스의 돌연변이 주파수를 측정하는 간단한 방법을 설명합니다. 접근 방식은 대부분의 생물 실험실에서 수행할 수 있습니다 종래의 virological 및 시퀀싱 기술을 사용합니다. 다른 바이러스의 번호와 경험을 바탕으로, 우리는 충실도 변종을 분리하고 통계적 의미의 데이터를 생성 가능성을 높이기 위해 최적화할 수 있어야합니다 핵심 단계를 확인합니다. 성실 변경 변이의 분리 및 특성은 효소의 구조와 기능 1-3에 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한, 이러한 충실도 변종 바이러스 적응과 진화 4-7의 메커니즘을 특성화에 유용한 도구가 될 수 있습니다.

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Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

현재 문서는 RNA 바이러스 및 조직 문화의 충실도 변경 사항을 확인하는 돌연변이 주파수 데이터를 사용하는의 RNA 중합 효소의 충실도 변종을 분리하고 특징하는 데 필요한 단계를 설명합니다.

바이러스 변이 주파수의 RNA 바이러스 및 특성화의 피델리티 변종의 분리

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

isolation-fidelity-variants-rna-viruses-characterization-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

29.5K 조회수.  Institut Pasteur. 현재 문서는 RNA 바이러스 및 조직 문화의 충실도 변경 사항을 확인하는 돌연변이 주파수 데이터를 사용하는의 RNA 중합 효소의 충실도 변종을 분리하고 특징하는 데 필요한 단계를 설명합니다.

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RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

의 RNA 격리 녹농균 Murine 위장관을 Colonizing

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

연구

면역학 및 감염병학

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

RNA 바이러스의 넓은 스펙트럼 화학 억제를위한 높은 처리량 검사

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

키메라 마우스 모델에서 재조합 인플루엔자 백신의 비강 관리는 점막 면역을 연구하기 위해

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

항 종양 특성을 가진 분리 및 호중구의 특성

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

세균 인공 염색체 : RNA 바이러스 양성 가닥의 연구에 대한 기능 유전체학 도구

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

새로운 세계 Zika 바이러스 전염성 클론으로부터 재조합 바이러스의 구조 및 특성 규명

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

인플루엔자 바이러스 단일 클론 항 체를 중화의 탈출 변종의 생성

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in diameter. MPs are a newly evolving, important part of cell-to-cell communication and signaling machinery. Because of their size and the nature of their release, until recently MP existence was overlooked. However, with improved technology and analytical methods their function in health and disease is now emerging. The protocols presented here are aimed at isolating and characterizing PMN-MPs by flow cytometry and immunoblotting. Moreover, several implementation examples are given. These protocols for MP isolation are fast, low-cost, and do not require the use of expensive kits. Furthermore, they allow for the labeling of MPs following isolation, as well as pre-labeling of source cells prior to MP release, using a membrane-specific fluorescent dye for visualization and analysis by flow cytometry. These methods, however, have several limitations including purity of PMNs and MPs and the need for sophisticated analytical instrumentation. A high-end flow cytometer is needed to reliably analyze MPs and minimize false positive reads due to noise or auto-fluorescence. The described protocols can be used to isolate and define MP biogenesis, and characterize their markers and variation in composition under different stimulating conditions. Size heterogeneity can be exploited to investigate whether the content of membrane particles versus exosomes is different, and whether they fulfill different roles in tissue homeostasis. Finally, following isolation and characterization of MPs, their function in cellular responses and various disease models (including, PMN-associated inflammatory disorders, such as Inflammatory Bowel Diseases or Acute Lung Injury) can be explored.

New protocols are described here to isolate and characterize microparticles derived from human and mouse neutrophils. These protocols utilize ultracentrifugation, flow cytometry, and immunoblotting techniques to analyze microparticle content, and they can be used to study the role of microparticles derived from various cell types in cellular function.

절연 및 특성화 Neutrophil 파생 된 미의 기능 연구

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of heterogeneous vesicles, whose size range between 40 and 1,000 nm. Accumulated evidence indicated that EVs play important regulatory roles in pathogen-host interactions. A deep understanding of schistosome EVs should provide insights into the mechanisms underlying schistosome-host interactions, enabling development of novel strategies against schistosomiasis. Here, we aim to further study EVs functions in schistosomes by presenting a protocol for the isolation and characterization of EVs from adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs were isolated from in vitro culture medium using centrifugation combined with a commercial exosome isolation kit. The isolated S. japonicum EVs (SjEVs) typically possess a diameter of 100 - 400 nm, and are characterized by transmission electronic microscopy and western blotting. The usage of PKH67 dye-labeled SjEVs has demonstrated that SjEVs are internalized by the recipient cells. Overall, our protocol provides an alternative method for isolating EVs from adult schistosomes; the isolated SjEVs may be suitable for functional analysis.