저자 데보라 해리스와 다니엘 맥케이 특히 빚을 수 있습니다. 이 작품에 대한 지원이 생물학과 CWRU의 예술과 과학의 대학의학과에서 제공하고, 생물 학적 과학의 학부 교육에 대한 지원 HHMI 부여 번호 52005866로.했습니다

1. 이미징 방법론 <ol><li> 그것은 동질적인 액체 될 때까지 20~30분을위한 55 ° C 학위 물 목욕에 젤리 글리세린을 용융. 소용돌이하지만, 거품의 형성을 피하기 위해 병을 흔들지 마세요. </li><li> 젤리가 녹으 동안 깨끗한 유리 슬라이드 (옵션)에 Kimwipe를 사용하여 글리세롤의 얇은 레이어를 적용합니다. </li><li> 녹은 글리세린의 피펫 1-1.5 ML 젤리 얇은 첫번째 레이어를 만들려면 슬라이드의 표면에 상처의 P1000의 피펫 팁을 사용합니다. 거품을 피하기 위해 조심스럽게 피펫. </li><li> 젤리가 수평 표면에 5 분 후, 5 분 -20 ° C에서 슬라이드를 장소와 배아 정렬로 이동합니다 고체화하자. 또는 사란 랩과 슬라이드를 커버하고 최대 5 일 4 ° C에서 그것을 놓으십시오. </li><li> 젤리 침구의 측면에 70 % 글리세롤 / PBS 또는 기타 antifade 글리세롤 기반 설치 미디어 (예 : Slowfade 또는 Vectashield)의 스테인드 배아의 작은 방울 피펫. </li><li> 개별적으로 젤리 표면에있는 드롭에서 그들을 전송하여 배아를 미리 정렬 시작합니다. 숟가락으로 한쪽으로 치우 쳤던 측면을 사용하여 한쪽으로 치우 쳤던 피하 바늘을 사용하여 전송합니다. </li><li> 대략 2-3 열 함께 배아를 놓습니다. 태아가 바늘에 걸리면, 다른 배아 그것을 릴리스가 포함된 드롭에 저어. 신중하게이 시점에서 그들을 정렬 시간을 낭비하지 마십시오. 열 사이에 공간을 둡니다. </li><li> 피하 바늘의 도움으로 젤리 매체에 수평을 슬라이딩하여 배아를 맞춥니다. 동안 슬라이딩, 방향 같은 방향으로 머리와 꼬리. 열에 따라 서로 그들이 평행합니다. 뒤틀린 Kimiwipe의 조각 흔적으로 남아 PBS의 글리세롤의 초과를 제거합니다. 참고 : 초과의 글리세롤이 어려운 잘라 탑재하고, 두 젤리 레이어의 분리의 결과로, 배아는 젤 이내 느슨하게 쌌다도록합니다. 반대로, 너무 글리세롤을 제거하는 건조하고 배아를 평평하게합니다. </li><li> 배아 (50-150 μL, 정렬 얼마나 많은에 따라 다름)를 통해 젤리의 얇은 레이어를 확산하기 위해 상처 노란색 팁을 사용하십시오. </li><li> 플레이스 10-20 분 -20 ° C의 냉동고에 슬라이드 또는 4 ° C 야간에 그것을 저장합니다. 젤리가 절단하기 전에 완전히 딱딱한 있는지 확인하십시오. 그렇지 않으면, 배아의 블록 소비세 매우 어려운 것입니다. 절단에 대한 최상의 결과는 그 다음날에 얻을 수 있습니다. </li><li> 해부 현미경, 정렬 태아의 양쪽에있는 젤리를 통해 완전히 잘라 면도날을 사용합니다. 바로 상처를 만들기 위해 90 ° 각도로 면도날을 잡아. 상처는 이미지를 막지 수 있습니다 여분의 젤리를 피하기 위해 태아의 앞쪽에 및 사후 기둥 매우 가까이하여야한다. </li><li> 추운 PBT (4 ° C, PBS 0.1 % 트윈 20) 상처 조심스럽게 주걱을 사용하여 태아 사이의 젤리를 긁어 옆에.의 100-200 μL 추가 참고 : PBT의 세제는 배아를 손상하지 않고 슬라이드에서 젤리의 제거를 도와줍니다. </li><li> 바늘을 사용하여 더욱 절단을위한 깨끗한 슬라이드에 포함된 배아와 젤리의 블록을 전송합니다. 5-7 배아와 작은 블록을 잘라. 쉽게 젤리 블록 이동에 PBT를 사용합니다. 또는, 그것이 필요한 경우 정확하게, 젤리를 트리밍에 대한 더 안정성을 만드는 유리에 부착하도록 건조 유리 표면에 블록을 놓으십시오. </li><li> 면도날과 바늘의 도움으로 젤리에 포함된 똑바로 배아를 플립. 현미경 시각화 들어, 사용중인 스탠드 현미경의 종류에 따라 아래의 두 단계 중 하나를 진행합니다. </li><li> 거꾸로 현미경 : 장소가 직립 위치에 태아와, 긴 coverslip에 배아 블록을 완료했다. 젤리의 최소 금액과 함께 배아의 측면이 목적으로 가까이 접촉하는 것임을 확인합니다. </li><li> 입식 현미경 : &quot;지원&quot;으로 사용하고있는 &quot;지원&quot;사이에 글리세롤의 배아 블록을 배치하는 superglue와 붙어 네 # 1 coverslips 두 개의 스택을합니다. 긴 coverslip을 사용하여 스택을 다리. </li><li> 공촛점 분석을 위해, 확인하는 데 사용할 목적의 작업 거리를 확인해 이미지 배아를 통해 모든 방법을하거나 일부만 여부. 예를 들어, D. melanogaster의 배아는 길이 ~ 0.55 mm을 가지고 전적으로 자이스 혈구 20x 계획 - APO 또는 40x LD 네오 플루어 목표를 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다. 다음 웹 사이트를 사용할 수 자이스 혈구의 목표에 대한 정보를 가지고 여러분에게 작업 거리에 따라 목표를 검색할 수있는 옵션을 제공합니다 : https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php을 </li></ol> 2. 대표 결과 배아가 그대로 유지되기 때문에이 방법은 태아의 크기와 유전자 발현 패턴 사이의 거리의 정확한 측정을하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 1에서, 우리는 핵 얼룩 DAPI (파란색), 안티 도설 단백질 (적색), SOG의 mRNA (노란색)와 SNA의 mRNA (녹색)와 스테인드 배반엽 스테이지 배아를 보여줍니다. 형태학의 procesSES, mesoderm의 invagination (그림 2A, B)와 mesodermal 세포 (그림 3 및 4)의 마이 그 레이션 등도이 방법을 사용하여 시각하실 수 있습니다. DV의 축을 따라 다른 Z - 위치가 같은 그림 2-4과 같이 초점 비행기를 변경하여 얻을 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 배반엽 단계에 손상 배아의 직립 광학 조각. mRNA와 단백질에 대한 이중 염색법. 현장 프로브의 (SOG 및 SNA)과 기본 항체 (안티 도설)의 스테인드 단백질에 대한 대상 mRNAs는 그림 표시됩니다. DAPI는 핵 레이블에 사용되었습니다. 도설의 표현이 핵 동안 SOG와 SNA의 표현이, 세포질에 apically 위치됩니다. 핵에 위치하고 있습니다 SOG 초기 성적에서 강한 신호도이 확대에서 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 손상 gastrulating 배아의 직립 영상. mRNA 프로브는 사용하고 각각의 색상은 그림 표시됩니다. A)이 단계에서, 세 유전자 같은 플루어 (녹색 SNA, SOG 및 dpp)와 스테인드합니다이 공간 분리 도메인에서 표현됩니다. invaginating mesoderm은 SNA를 표현, neuroblast 계층이 산업을 표현하고 SOG의 표현은 여전히 신경 시스템의 복부 지역에있는 동안 ectoderm은 dpp를 표현합니다. B) 같은 배아의 깊이 공촛점 비행기, 우리는 강하게 SNA을 표현 invaginating mesoderm의 기반을 참고하지만, 그 꼭대기의 지역은 낮은 수준을 표현하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. . 달팽이, 산업 및 dpp의 mRNAs (녹색), 도설 단백질 (빨간색), 세균 밴드와 손상 배아의 입식 영상은 SOG RNA (노란색)을 확장. 핵은 DAPI (파란색)와 스테인드되었습니다. 배아의 머리 근처) 초점 비행기. 같은 배아의 트렁크 지역에서 B) 또 다른 초점 비행기. 세균 밴드 확장 배아의 양쪽에 가까운 복부 정중선 거짓말하는 측면 마이 그 레이션하기 전에 mesodermal 세포 (4 그림과 비교할 때)의 참고 질량. Delaminating neuroblasts는 녹색 (산업 및 SNA)에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 세균 대역 확장하는 동안 손상 배아의 입식 이미징 SOG RNA (노란색). 달팽이, 산업 및 dpp의 mRNAs (녹색), 도설 단백질 (빨간색). A), 상피 (화살표)에서 delaminating neuroblasts 참고이 단계 (녹색)에서 산업 및 SNA에 대해 모두 스테인드. SOG의 제한된 표현은 배면의 정중선 (노란색) 또한 있습니다. 이 단계에서 dpp 표현은 배아 (별표)의 측면 양쪽에서 볼 수 있습니다. B) 같은 배아의 광학 섹션 중순 후부 지역에 해당하는 배아 길이의 끝 부분에 표시됩니다. 복부 정중선 세포가 SOG를 위해 얼룩이 있습니다.

<ol>
	<li>Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+and+analysis+for+quantifying+gene+expression+from+early+Drosophila+embryos.">Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos.</a> Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).</li><li>Gr&#946;hans, J., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+link+between+morphogenesis+and+cell+division+during+formation+of+the+ventral+furrow+in+Drosophila.">A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila.</a> Cell. 101, 523-531 (2000).</li><li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li><li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-on+imaging:+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos.">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).</li><li>Zander, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+mounting+delicate+bryophytes+in+glycerol.">On mounting delicate bryophytes in glycerol.</a> The Bryologist. 100, 380-382 (1997).</li><li>Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+the+Dorsal+nuclear+gradient+reveals+limitations+to+threshold-dependent+patterning+in+Drosophila.">Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

그것이 조각 2 보통 형광 stainings에 대한 해로운 것입니다 마이크로톰 처리, 임베디드 미디어의 사용 중주의 손 절개를 필요로하기 때문에 Drosophila의 배아의 단면 이미지를 촬영하는 것은 도전하실 수 있습니다. 또는 공촛점 현미경에서 만든 Z - 스택은 단면 이미지의 3D 재건을하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 정확한 3D 재건과 photobleaching problematical되어 여러 얇게 공촛점 조각 만들기 위해 소모 시점입니다. 길이 방향 탑재되어 영상 태아도 단백질 또는 mRNA 표현 수준 1 부량의 목적을 위해 형광 신호의 정확한 측정을 복용 복잡 배아의 깊은 부분에 도달하면 발생하는 광 산란 또 다른 관심사. 심지어 두 광자 공촛점 현미경으로 빛이 산란은 여전히​​ 제한 샘플 최적의 투명성에 대한 설치 매체의 선택을 만드는 배아의 중간에 노른자 소재의 불투명도에 의한 관심사입니다. 이러한 문제를 회피하려면, 위치 배아의 &quot;최종의&quot;이미지라는 새로운 기술은 수직으로 최근 4 살 및 고정 샘플 모두 이미지로 개발되었습니다. 본 논문에서는, 우리는 현장 프로브 3 여러 물들일되는 크기와 모양의 고정 배아 또는 조직의 간단한 준비 및 시각화를 허용 수직으로 장착 태아를위한 새로운 프로토콜을 개발했습니다. 우리의 방법은 그 안에서 정렬 배아를 싸는 데 사용되는 젤라틴 일관성있는 장착 미디어를 사용하여 구성됩니다. 임베디드 배아를 포함하는이 장착 미디어 컷 블록은 공촛점 현미경의 어떤 유형의 이미징 전에 직립 위치 수 있습니다. 젤리에 배아를 포함하고 수직으로 그들을 위치함으로써, 우리는 배아의 지느러미 - 복부 축을 따라 세포가 동시에 제공되는 공촛점 현미경을 사용하여 수평 교차 섹션을 수 있습니다. 이것은 빛을 산란과 길이 방향 탑재 배아들 중 기존의 Z - 스택 재건에서 발생하는 형광 염료의 photobleaching 지금 제거 아르의 문제 때문에 부량을 위해 상당한 개선이다. 반대 지느러미 - 복부 위치에있는 세포가 동시에 같은 공촛점 Z - 위치에서 몇 군데 있기 때문에 따라서, 지느러미 - 복부 축을 따라 유전자 발현 또는 단백질 수준의 부량은 정확합니다. 또한, 설명 방법은 우리가 DV 축 6 따라 다른 위치에 세포를 시각화하기 위해 복잡한 계산 unrolling 방법을 사용하지 않고 3 - D 배아에서 지느러미 - 복부 축에 걸쳐 완벽한 2 - D 이미지를 얻을 수 있습니다. 중요한 단계 중 일부는 젤리의 두 레이어 사이의 분할 피하기 위해, 배아를 정렬 후 여분의 글리세롤을 제거 있습니다. 그러나, 샘플도 탈수있다면, 그 결과 이​​미지가 결함이하고 잘못된 형태가됩​​니다. 배아 주변 젤리 매체가 아니라 바로 이상의 각도로자를 경우뿐만 아니라, 결과 이​​미지는 90도 이외의 각도로 배아의 잘못된 위치로 인해, 모양의 적은 둥근 더 ovular 나타날 수 있습니다. 젤리가 앞쪽에 / 사후 끝에 배아와 밀접하게 충분한 절단되지 않는 경우 마지막으로, 그것은 목표의 작동 거리가 주로 젤리 아니라 배아에 초점을 사용하는 것입니다 때문에 적절한 이미지를 얻을 수 없습니다. 영상 후반 gastrulating 배아는 신중하게 정렬하기 전에 범위에 따라 관심의 단계를 정렬할 때 필요할 수 있습니다 또 다른 중요한 단계. 보통 태아는 세로 위치에서 가장 쉽게 인식된다 형태학의 특성에 따라 개최됩니다. 이 방법으로 만들 수 대체 수정 중에서 형광 염료의 photobleaching으로부터 보호하기 위해 젤리의 두 번째 계층에 방지 퇴색 시약 (예 : P - Phenylenediamine 또는 PPD) 포함하는 것입니다.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycerin Jelly mounting media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences Company</td>
<td>17998-10</td>
<td>Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997.</td>
</tr>
<tr>
<td>Zeiss LSM 700 Confocal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm).</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass microscope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-544-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72204-02</td>
<td>Size 1 &frac12; (specific for the objectives used in this work).</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass cover slips (for making supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherfinest</td>
<td>12-544-10</td>
<td>Use four coverslips glued with superglue. </td>
</tr>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop</td>
<td>M420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Steel back single edge industrial blades</td>
</tr>
<tr>
<td>Spatula</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>21-401-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hypodermic needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>1482610</td>
<td>26 Gauge</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

upright imaging of drosophila embryos

몇 가지 잘 알려진 morphogenetic의 그라디언트 및 세포 움직임의 지느러미 / 복부 축을 따라 발생<em&gt; Drosophila</em&gt; 배아. 그러나, 이러한 프로세스를 보려면하는 데 사용되는 현재의 기술은 다소 제한됩니다. 다음 프로토콜은 고정 및 라벨 장착을위한 새로운 기술을 설명합니다<em&gt; Drosophila</em&gt; 공촛점 이미지와 코로나 볼 배아. 이 방법은 글리세린 젤리 장착 미디어의 두 레이어 사이의 배아를 포함 구성되어 및 이미징 젤리 스트립은 직립 위치. 배아를 sandwiching위한 첫 번째 단계는 슬라이드에 글리세린 젤리의 얇은 이불을하는 것입니다. 다음 배아는 신중하게이 표면에 정렬과 젤리의 두 번째 계층 덮여있다. 두 번째 레이어가 확정되면 젤리의 스트립은 절단 및 이미징을위한 직립 뒤집혀 있습니다. 대안은 사용할 수 현미경 스탠드의 종류에 따라 배아를 시각화에 대해 설명되어 있습니다. 지느러미 - 복부 축을 따라 모든 세포가 하나의 공촛점 Z - 비행기 내에 몇 군데 있기 때문에, 우리의 방법은 길이 방향 탑재 배아의 3D reconstructions 일반적인 분산을 photobleaching 또는 조명없이 정확한 측정과 형광 신호의 비교를하실 수 있습니다.

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Upright Imaging of Drosophila Embryos

여기 스테인드에 대한 마운트 프로토콜을 제시<em&gt; Drosophila</em&gt; 공촛점 현미경을 사용하여 크로스 - 섹션의 영상을 허용 직립 위치에 배아.

의 입식 이미징 Drosophila 태아

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Research

JoVE Journal

Biology

Upright Imaging of Drosophila Embryos

9.2K 조회수.  Case Western Reserve University. 여기 스테인드에 대한 마운트 프로토콜을 제시 Drosophila 공촛점 현미경을 사용하여 크로스 - 섹션의 영상을 허용 직립 위치에 배아.

비디오: Upright Imaging of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Midgastrula 스테이지 Drosophila의 태아에서 문화의 연결 준비

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

연구

생물학

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

의 준비 Drosophila</em공중 드롭 프로토콜을 사용하여 라이브 영상을위한> 태아

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

수확 및 준비 Drosophila</emElectrophysiological 녹화 및 기타 수속을위한> 태아

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

의 전자 현미경을위한 배아의 준비 Drosophila 태아의 심장 관

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

라이브 해부 Drosophila 태아 : 항체 스테 이닝에 의해 돌연변이 컬렉션을 검사 늘씬한 방법

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

Drosophila의 배아들 중에서 - 생체내의 원심 분리

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

에서 기본 셀 문화 Drosophila Gastrula의 태아

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

dsRNA 주입하여 RNAi 간섭에 Drosophila 태아

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

생활의 이미징 셀 모양 변경 Drosophila 태아

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Kinesin의 분리 및 정제에서 Drosophila 태아

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...