This research was funded by the Canadian Regulatory System for Biotechnology (CRSB) and Chemicals Management Plan (CMP) initiatives.

동물 사육, 유지 보수 및 처리를 포함한 모든 프로토콜은 건강 캐나다의 동물 보호위원회에 의해 승인되었다. 1 동물 노출 <ol><li> 무작위로 선택된 관리 시간에 대한 적절한 노출 경로로 시험 화합물 및 관련 제어 그룹 및 치료 그룹 (최소 그룹 당 = 5) .Treat 마우스를 제어하는​​ (8~12주 이전) 형질 전환 수컷 마우스를 배포 할 수 있습니다. 관심 정자 세포 형 (도 3)에 따라 적절한 샘플링 시간을 선택. </li><li> 샘플링 시간 후, 이소 플루오 란 마취하에 자궁 경부 전위 (또는 다른 적절한 방법)에 의해 쥐를 안락사. 조심스럽게 마미의 epididymides을 복부 또는 음낭 절개에서 고환을 그리고 절제. (그림 4, 부고환 컬렉션의 상세한 영상을 볼 Duselis 등. 24 볼). 정소 세관을 분석하는 경우에 대안 적으로, 고환 수집의 세포. 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 액체 질소 저장에 냉동. </li></ol> 2 분리 및 소화 카우 정자의 <ol><li> 얼음 카우 부고환을 제상. 페트리 접시에 해동 카우를 전송하고 철저하게 메스 나 면도기 블레이드 말하다. </li><li> 페트리 접시에 실온 D-PBS 700 μl를 추가합니다. 그리기 및 D-PBS 정자 (약 10 배) 흐린 될 때까지 정지를 해제하여 카우에서 와이드 보어 1000 μL 피펫 팁, 릴리스 정자를 사용. 참고 : 넓은 구멍 피펫 팁을 준비하려면 플라스틱 피펫 팁의 끝에서 2-3mm를 잘라. </li><li> 1.5 ml의 신선한 관에 스테인레스 메쉬 필터를 통해 필터 현탁액. D-PBS의 추가 700 μL와 페트리 접시를 씻고 메쉬 필터를 통해 동일한 1.5 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. 얼음에 튜브를 놓고 메쉬를 제거합니다. </li><li> 반복하여 나머지 샘플에 대한 2.1-2.3 단계를 반복합니다. </li><li> 3 분 동안 11,000 XG samplesat 스핀. 조심스럽게 캔트 상층. 펠렛을 방해하지 마십시오. </li><li> 1.0 ml의 차가운 1X 식염수 구연산 나트륨 (SSC)를 추가합니다. 펠렛까지 소용돌이를 완전히 다시 일시 중단됩니다. 이것은 때때로 소용돌이로 교반 몇 차례를 취할 것입니다. </li><li> 10 % SDS의 15 μl를 추가합니다. 반전 / 비 정자 세포를 파괴하기 위해 30 초 동안 흔들어. 너무 부드럽게 흔들리는 것은 불충분 중단 될 것이며, 펠릿은 다음 단계에서 제대로 형성되지 않습니다. </li><li> 2 분 동안 11,000 XG에 스핀. 이른바 &quot;무성&quot;펠릿 부족 단계 2.7에서 진탕 체세포 분열 불완전한 나타낸다. 이 경우, 단순히 다시 샘플을 흔들어 꽉 펠릿이 형성 될 때까지 리 스핀. 조심스럽게 상층 액을 가만히 따르다. 펠렛을 방해하지 마십시오. 간단히 다시 회전 및 200 ㎕를 피펫으로 남아있는 상층 액을 제거합니다. </li><li> 펠릿을 재현 탁 할 때까지 940 μL의 0.2 배 차가운 SSC와 소용돌이를 추가합니다. 이 펠릿을 다시 중단하기가 매우 어려울 수 있습니다 및 볼텍스를 몇 차례 걸릴 수 있습니다. S의 경우에 덩어리파마는 피할 수 있습니다. </li><li> 120 μL의 β-머 캅토 에탄올, 100 ㎕의 10 % SDS, 20 ㎕의 0.5M EDTA, pH가 8, 20 μL의 단백질 분해 효소 K을 (60 밀리그램 / ㎖, 신선한 준비)를 추가합니다. 잘 혼합하고 37 ° C에서 회전 하룻밤 소화. 페놀 / 클로로포름 추출을 진행합니다. </li></ol> 카우 정자에서 DNA의 3 페놀 / 클로로포름 추출 참고 : 후기의 정자 성숙 정자의 핵 DNA는 프로타민 착화되고, 높은 체세포의 DNA에 비해 응축되어 있기 때문에, 기존의 핵산 분리 방법은 돌연변이 분석이 작동하기에 충분한 수율과 고순도의 DNA를 생성하지 않습니다 효율적. 공격적인 소화 후 여러 페놀 - 클로로포름 추출을 해제하고 (15에서 방법에 따라) 정자 DNA를 정화해야합니다. <ol><li> 전송 정자 세포는 15 ㎖의 폴리 프로필렌 튜브에 다이제스트. </li><li> 혼합물을 클로로포름 : 페놀 2 ㎖ (1 : 1). 22 rpm에서 튜브를 회전3 분. </li><li> 10 분 동안 1,600 XG에 원심 분리기와 신선한 15 ML 튜브에 퍼지 인터페이스 계층과 함께 수성 상위 계층을 전송합니다. </li><li> 반복 3.1.2과 3.1.3 배, 그러나 각각 3 분, 4 분, 6 분,로 회전 시간을 변경하는 단계를 반복합니다. 최종 반복에서, &quot;퍼지&quot;계면 층 중 하나를 전송하는 피. </li><li> 이소 아밀 알코올 (24 : 1) 네 번째 추출 후, 3M NaAc, pH가 5.2 일 당 수성 추출물 ml의 클로로포름 2 ㎖의 70 μl를 추가합니다. 12 분 동안 22 rpm에서 튜브를 회전합니다. </li><li> 10 분 동안 1,600 XG에 원심 분리기와 신선한 15 ML 튜브에 수성 상위 계층을 전송합니다. </li><li> 무수 에탄올의 두 볼륨을 추가하고 부드럽게 부드러운 락과의 측면에 튜브를 회전하여 DNA를 침전. </li><li> 열 밀봉 목초지 피펫의 팁에 감아 DNA를 수집합니다. 5 분 동안 70 % 에탄올 및 공기 건조에 피펫 팁을 소용돌이에 의해 DNA를 씻어. </li><li> 100 ㎕의 트라이 - 추출 후 40 DNA 침전물을 용해S-EDTA 버퍼, pH를 4 ° C에서 8 점. DNA는 lacZ의 돌연변이 분석을 진행하기 전에 이일 최소 4 ° C에서 용해 할 수 있습니다. 용해도 문제가 발생하면, DNA가 더 사용하기 전에 15 분 동안 65 ° C에서 용해 될 수있다. 260에 spectrophotometre와 DNA의 농도를 결정하고 용해 된 DNA의 농도가 200-2,000 NG / μL 사이에 있는지 확인합니다. </li></ol> 정 세관에서 생식 세포 (4) 분리 및 소화 <ol><li> 동결시, 얼음 (약 1 시간)를 고환을 해동. 전송 그라운드 유리판 정소. </li><li> 포셉 한 쌍의 고환의 한쪽 끝을 잡고. 고환의 타단에, 또 한 쌍의 집게 나 해부 가위 (도 5a)를 사용하여 상피 캡슐에 구멍을 천공. 구멍을 통해 정 세관을 쥐고 상피 캡슐 (그림 5B)를 폐기합니다. </li><li>DD 디 캡슐화 정 세관에 실온 D-PBS 500 μL. </li><li> 각도 티슈 롤러되도록 일단이 5-10 ° (도 5c)의 대략적인 각도 플레이트와 접촉하는 (실리콘 고무 밀접 자유롭게 회전 5mm 직경의 스테인레스 스틸 튜브, 또는 유사한 장치 위에 장착). 어떤 압력을 적용하지 않고, 부드럽게 그들이 평평하게 될 때까지 세관에 걸쳐 앞뒤로 롤러를 이동하고 D-PBS 출시 세포 (약 5-10x) 흐린된다. </li><li> 몇 번 더 추가 세관을 통해 D-PBS의 또 다른 500 μl를 추가하고 부드럽게 세관 롤오버. </li><li> 전송되는 분리 세뇨관의 양 (도 5D)를 최소화하면서 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송. </li><li> 를 반복하여 필요한 경우 더 많은 세포를 수집 4.5-4.6 단계를 반복합니다. </li><li> 어떤 실수로 수집 된 세관은 튜브의 바닥에 정착 할 두 분 - 1을 허용합니다. FR에 D-PBS로 이동정착 세관 (D-PBS의 약 100 μL)을 남겨두고 1.5 ml의 튜브를 환경 안전 보건. 이 현탁액의 분취 액 적은 세포 집단의 조성물을 평가하기 위해 현미경 (위상차)에서 확인할 수있다. </li><li> 30 초 동안 11,000 XG에서 세포를 스핀 다운. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 가만히 따르다. 필요한 경우 세포 펠렛이 시점에서 -80 ° C에서 냉동 될 수있다. </li><li> 필요한 경우 세포를 해동. 용해 완충액 5 ㎖에 15 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 resuspend 세포로 전송 (10 mM 트리스 pH가 7.6, 10 mM의 EDTA, 100 mM의 염화나트륨, 1 ㎎ / ㎖ 프로 티나 제 K, 1 % SDS). 하룻밤 회전 배양기에서 37 ° C에서 다이제스트. </li><li> 페놀 / 클로로포름 추출을 진행합니다. </li></ol> 정액을 운반하는 Tubule 생식 세포에서 5 페놀 DNA의 / 클로로포름 추출 참고 : 덜 공격적 추출 이러한 종류의 세포는 아직 N을 통해 진행되는 형식을 갖고 있지 않기 때문에, 정 세관의 생식 세포 DNA를 분리하는 데 사용됩니다uclear 응축. <ol><li> 클로로포름 혼합물 (1 : 1)에 하룻밤 정 세관 세포 소화 페놀의 5 ML을 추가합니다. 20 분 동안 22 rpm에서 튜브를 회전합니다. </li><li> 를 10 분 동안 1,600 XG에 원심 분리기와 신선한 15 ㎖의 튜브에, &quot;퍼지&quot;계면 층을 피하면서, 수성 최상부 층을 옮긴다. </li><li> 5 mL의 수성 추출물을 5 M의 NaCl 100 μl를 추가합니다 (보통 5 ㎖를 복구) </li><li> isoamylalcohol 클로로포름 5 ㎖에 추가 (24 : 1). 12 분 동안 22 rpm에서 튜브를 회전합니다. </li><li> 10 분 동안 1,600 XG에 원심 분리기와 신선한 15 ML 튜브에 수성 상위 계층을 전송합니다. </li><li> 무수 에탄올이 첨가 볼륨을 부드럽게 회전 튜브를 반전시킴으로써 DNA를 침전. </li><li> 밀봉 목초지 피펫의 팁에 감아 DNA를 수집합니다. 5 분 동안 70 % 에탄올 및 공기 건조에 피펫 팁을 소용돌이에 의해 DNA를 씻어. </li><li> 40-100 ㎕의 트리스-EDTA 버퍼, pH를 4 ° C에서 8 스토어에서 DNA를 녹인다. DNA는이 최소 4 ° C에서 용해 할 수 있도록 허용일 lacZ의 돌연변이 분석을 진행하기 전에 (단계 3.9 참조). 용해도 문제가 발생하면, DNA가 더 사용하기 전에 15 분 동안 65 ° C에서 용해 될 수있다. 260에 spectrophotometre와 DNA의 농도를 확인하고 농도가 200와 2000 NG / μL 사이에 있는지 확인합니다. </li></ol> 6 LacZ를 돌연변이 분석 세균 또는 진균의 오염은 패키징 효율뿐만 아니라, 플라크의 성장을 방해하고 채점 할 수있다. 그것은 장비 반응, 호스트 배양 및 성장 매체의 오염을 방지하기위한 적절한 조치를 이용한 무균 lacZ의 분석을 수행하는 것이 중요하다. <ol><li> 일 분석하기 전에 : 아래 한천 및 숙박 문화를 준비 <ol><li> 여덟 판 각각 샘플 당 필요한 한천 8 ㎖의 바닥을 포함 (4 판 역가를 계산, 4 판을 돌연변이 점수) (즉., 64 ㎖의 샘플 당). 바닥 한천은 모두 동일합니다돌연변이 및 역가 카운트 접시. 샘플의 수는 처리되는 충분한 하부 한천을 준비한다. 무균는 90mm 배양 접시 (접시 당 8 ㎖)에 부어 한천이 응고 할 수 있습니다. NOTE : 하부 한천 플레이트를 사전에 일주까지 제조 할 수있다. </li><li> 50 ML 튜브에 10 ㎖의 LB 배지, 20 % 맥아당 용액 100 μL, 25 μL의 암피실린 (20 ㎎ / ㎖) 20 ㎕를 카나마이신 (5 ㎎ / ㎖)를 추가합니다. E. 접종 대장균 (lacZ의 - / 게일 -) 25, 240 rpm에서 진탕 37 ° C에서 하룻밤 성장한다. </li></ol></li><li> 1 일 : 하위 문화 셀 <ol><li> 신선한 LB (항생제)에서 하룻밤 문화의 백 희석 : 일을 준비하여 하위 세포를 배양. 하위 문화의 8 ML의 볼륨은 샘플 당 필요합니다. OD 600 = 1 때까지 약 3.5 시간 동안 240 rpm으로 진탕 37 ° C에서 품어. </li><li> 때 OD 600 = 1, 10을 15 ° C에서 1,300 XG에 분할 세포 50 ML 튜브에 균일하게 서스펜션과 원심 분리기분. 상층 액을 제거하고 (예., 샘플 당 4 ml)에 LB의 10 mM의 황산이 포함 된 원래 볼륨의 절반에 세포를 일시 중지 재. [단계 6.2.4.3]을 필요할 때까지 옆으로 세포를 넣습니다. </li></ol></li><li> 1 일 : 람다 파지 입자에 DNA를 포장 <ol><li> 30 ° C에 물을 욕조를 따뜻하게. </li><li> 와이드 보어 10 μL 피펫 팁, 1.5 ML 튜브로 전송 4 μL의 DNA를 사용하여. 주 :이 단계는 준비 시간을 줄이기 위해 사전에 하루 이상을 행할 수있다. </li><li> 파지 포장 추출 키트에서 제 1 튜브 (적색) (모든이 샘플에 대한 1 관)를 따뜻하게. 간단히 튜브의 하단에있는 추출물을 수집하는 스핀. </li><li> DNA 샘플에 대한 첫 번째 관에서 포장 추출물의 4.8 μl를 전송하고 피펫 팁과 부드러운 교반 혼합한다. 간단히 튜브 샘플을 스핀 다운. 30 ° C의 물을 욕조에 1.5 시간 동안 품어. </li><li> 초 (파란색) 포장 추출 튜브 (~ 15 샘플에 대한 1 관)를 따뜻하게. 간단히 하단의 추출물을 수집하는 스핀관. </li><li> DNA 샘플의 두 번째 튜브에서 포장 추출물의 4.8 μl를 전송하고 부드러운 교반 혼합한다. 간단히 튜브 샘플을 스핀 다운. 30 ° C의 물을 욕조에 추가로 1.5 시간 동안 품어. </li><li> 500 μL의 SM 완충액에 패키지 파지 입자를 일시 중지하고 다시 20 rpm으로 30 분 동안 회전하여 혼합한다. </li><li> 튜브의 하단에 샘플을 수집하기 위해 30 초 동안 11,000 XG에 잠시 소용돌이 샘플 및 원심 분리기를 회전 한 후. 파지 입자는 감염 [단계 6.2.4]에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol></li><li> 1 일 : 최고 한천을 준비 <ol><li> 역가 판과 돌연변이 선택 플레이트에 대해 별도의 최고 한천을 준비합니다. 각 샘플은 4 역가 플레이트, 4 돌연변이 판을 필요로한다. 각 판은 8 ml의 최고 한천이 필요합니다. 만 한천 돌연변이 선택 가기 선택제 페닐-β-D-갈 락토 피 (P-갈)를 추가합니다. 모두 최고 한천 사전에 (분석의 일)를 준비하고 모두 최고 한천에 황산을 추가하기 전에 50 ° C로 유지하고, PG알은 선택 한천의 돌연변이입니다. </li></ol></li><li> 1 일 : 포장 된 파지 및 도금에 감염 세포 <ol><li> 샘플 당이 50 ml의 튜브 레이블 : 샘플 당 한 &quot;돌연변이&quot;튜브 및 샘플 당 1 &quot;역가&quot;관 </li><li> 샘플 당 4 &quot;돌연변이&quot;접시와 샘플 당 4 &quot;역가&quot;판 : 샘플 당 판 한천 라벨 8 </li><li> 나누어지는 각 튜브 [단계 6.2.1.2에서] 현탁 세포 2 ㎖. </li><li> 에 &quot;돌연변이&quot;50 ML 튜브 (포함하는 셀) [단계 6.2.2.8에서] 포장 파지 입자의 500 μl를 추가합니다. 조심스럽게 혼합하여 파지 입자를 실온에서 30 분 동안 세포를 감염시킬 수있다. </li><li> 30 분 후, 잠시 소용돌이가 세포를 감염 (세포를 포함하는) 적절한 50ml의 &quot;역가&quot;튜브에 감염된 세포의 15 μl를 전송합니다. </li><li> 판 역가 샘플에, 따뜻한 (50 ° C) &quot;역가&quot;최고 한천 (포함하지 않는 P-갈)을 &quot;역가&quot;50 ML 튜브의 30 ML을 추가합니다. 즉시 DISTRIB4 &quot;역가&quot;한천 플레이트 사이 UTE / 세포 혼합액 (~ 플레이트 당 8 mL)을 첨가 하였다. 상단 한천은 피펫에 냉각 및 공기 방울을 소개하지 않는 시도를하지 않도록 신속하게 작업 할 수 있습니다. </li><li> 다음 &quot;돌연변이&quot;샘플 플레이트. P-갈이 &quot;돌연변이 선택&quot;최고 한천에 추가되어 있는지 확인합니다. 따뜻한 &quot;돌연변이 선택&quot;한천 (포함하는 P-갈)을 &quot;돌연변이&quot;50 ML 튜브의 30 ML을 추가합니다. 즉시 (~ 접시 당 8 ㎖) 4 &quot;돌연변이&quot;판 사이 한천 / 세포 혼합물을 배포 할 수 있습니다. </li><li> 판 다음 (~ 15 분) 강화 반전 밤새 37 ° C에서 배양 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 주 2 : 계산 플라크 <ol><li> 밤새 배양 한 후에, 돌연변이 및 역가 플레이트에 플라크의 수를 계산. 플라크 다수 들어, 전체 개수를 추정하기 위해 판의 부분만을 카운트 (예. 종종 ¼ 타이 터 플레이트의 사이 100-200 플라크있을 것이다). 100 플라크의 최소 때를 기를 접시 당 계산해야한다플레이트 부 nting. </li><li> 세포의 μL 당 플라크 형성 단위 (PFUs)의 수를 계산합니다. 이 도금 셀 체적 (15 μL)에 의해 &quot;역가&quot;플레이트에 플라크의 개수를 나눔으로써 수행된다. </li><li> / μL &quot;돌연변이&quot;판 (PFUs / μL의 *의에 도금 감염된 세포의 총 부피에 PFUs의 총 수를 추정하기 PFUs의 수를 사용하여 [2 ㎖의 세포 + 0.5 ㎖의 패키지 파지 입자 - 역가 플레이트 15 μl를] ). </li><li> &quot;역가&quot;플레이트로부터 결정 감염된 세포의 총 부피에 PFUs의 예상 총 개수에 의해 4 &quot;돌연변이&quot;플레이트에 플라크 카운트 돌연변이의 전체 수를 나누어 MF 견적. </li></ol></li><li> 그것은 MutaMouse 배아 세포, OECD 가이드 라인은 동물 수 스크린 당 125,000 ~ 300,000 비 돌연변이 PFUs 최소 권장으로서 자발 lacZ의 MF는 대조군의 3 × 10-5의 순서로되면안정적인 기준 신호를 얻기 위해 돌연변이 ED. 기타 형질 전환 모델은 PFUs 더 많은 수의이 필요할 수 있는데,이 경우에 낮은 자연 MF가있을 수 있습니다. 통계적 전력 시험 원하는 해상도를 얻기 위해 필요한 PFUs 동물의 최소 수를 결정하기 위해 수행 될 수있다. 다중 반복 실험의 데이터는,이 최소 PFU 요구 사항을 충족시키기 풀링들은 상당히 상이한 돌연변이 주파수를 생성하지 않는 제공 될 수있다. </li></ol> (7) 통계 분석을위한 실험 장치는 마우스이다. 이 분석에서 생성 된 데이터는 일반적으로 정규 분포되지 않습니다. 이와 같이, 데이터의 분포 특성에 기초하여 분석을위한 통계적 방법을 선택한다. NOTE : 적절한 데이터 변환 observa의 범위에 걸쳐 응답의 분산을 동등하게 적용되는 경우 기본 파라 메트릭 분석 (. 예 ANOVA)을 채용 할 수있다기. 푸 아송 또는 이항 회귀 분석은 종종 더 적합합니다. 비모수 분석이 또한 사용될 수있다. 우리는 일상적으로 일반화 된 선형 모델 절차를 사용하여 포아송 회귀 분석을 사용 (예., 시저 GENMOD) 르뮤 등 (26)에 의해 설명 된대로 SAS의 v.9.2에서 (SAS 연구소, 캐리, NC).

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The authors declare that they have no competing financial interests.

전통적인 방법에 비해 TGR 생식 세포 돌연변이 분석은 생체 생식 세포 돌연변이 유도 정량화보다 빠르고 경제적, 더욱 민감한 방법을 제공한다. 자손, 동물의 수는 대조적으로, 정자 직접 트랜스 MF를 평가함으로써, 시간 및 단일 화합물의 생식 계열 돌연변이를 평가하는 데 필요한 자원이 크게 감소된다. 감도의 관점에서, 우리는 투여 그룹당 5 동물을 사용하여 25 밀리그램 / kg의 ENU 노출 다음 정조 세포 줄기 세포에서 상당한 MF 2.6 배 증가를 검출 할 수 있었다. 반면, 특정 궤적 분석은 사용이 동일 투여 MF에 중대한 변화&gt; 노출 된 그룹의 3000 마우스와&gt; 500,000 제어 마우스 (28)를 감지 할 수 없습니다. 두 기작 및 규제 조사에 대한 적합성에 추가하여,이 방법은 체세포와 생식 라인 mutati 간 비교 연구를위한 기회를 제공한다오늘. 최근의 증거는 체세포 돌연변이에 필요한 것보다 일부 에이전트에 대한 생식 세포 돌연변이가 낮은 농도로 유도 될 수 있음을 시사한다. 예를 들어, N-hydroxymethylacrylamide에 장시간 노출되면, 음식 발암 아크릴 아미드 (12)의 대사 산물, 적혈구 소핵 주파수 체세포 염색체 손상 (13)의 기존의 측정 값에 영향을 미치지 않고 생쥐에서 지배적 치명적인 생식 세포 돌연변이의 빈도를 증가시킨다. 또한, 혈액 소핵 주파수 14 증가하지 않는 용량에서 정자의 탠덤 반복 DNA 유전자 좌에서 모두 주류 및 사이드 스트림 담배 연기 원인 높은 돌연변이 주파수에 마우스의 노출. 이러한 결과는 체세포 유전자 독성 시험은 항상 생식선의 보호적인 가정에 도전하고 생식 세포 돌연변이 빈도를 정량화하기위한보다 효율적이고 비용 효과적인 방법에 대한 요구를 강화한다. 그러나, 우선 생식 세포 변이원성에 대한 증거는 아직 약하다대체로 인한 체세포 및 생식 세포 조직에서 돌연변이율을 비교 가능한 데이터의 부족. TGR 돌연변이 분석은 병렬 테스팅과 같은 형질 전환 유전자를 이용하여 여러 조직에서 유도 된 돌연변이의 비율의 비교를 허용한다. 따라서, 비교 돌연변이는 생식 세포 특수한 효과의 가능성을 둘러싼 데이터 차이를 보충하는 데 유용한 TGR 분석법을 사용하여 테스트. 테스트에 대한 규제 체세포 및 생식 세포 돌연변이의 동시 평가는 또한 필요한 동물의 수를 줄여 효율을 향상시킬 것이다. 체세포 돌연변이에 대한 OECD 가이드 라인은 삼일 샘플링 시간 (3 + 28) 다음 이십팔일 관리 시간을 권장합니다. 이 정자의 spermatocyte 및 spermatid 단계 (그림 3) 중 대부분 노출 된 세포를 대상으로하기 때문에 카우 정자의 분석은,이 시점에서 가난한 감도를 제공 할 수 있습니다. 이 단계의 세포는 DNA를 합성하고 점진적으로 DNA 수리 (6)에 대한 능력을 잃지 않는 &lt;/ SUP&gt;. 또한,이 시점에서 샘플링 카우 정자 정조 세포는 줄기 세포에서 일어나는 돌연변이를 발견하지 못할 것이다. 따라서, 28 + 3 디자인에 통합, OECD 가이드 라인은 정 세관에서 생식 세포를 수집하는 것이 좋습니다. 이 혼합 인구는 DN​​A 합성과 줄기 세포를 포함한 수리 능숙 세포 유형으로부터 유래 된 세포를 포함하고, 정자 형성 단계의 대부분에 걸쳐 노출되어있다. 그러나, 이들 세포의 혼합 특성상, 정 세관 세포 분석은 위상 관련 정보를 제공하지 않는다. 또한, 비 - 표적 세포의 존재가 관찰 MF에 영향을 미칠 수 있다는 우려가있다 (예 인해 DNA 복구 결손 생식 세포에서 돌연변이 된 생식 세포 신호의 변이 된 체세포의 오염, 또는 희석에 가양 생식 세포 돌연변이 호출) . 현재 체결 부족한 데이터가 있는지 여부 28 + 세 제공하는 동일한 민감도와 특이도에서 정 세관 세포의 결과나중 시점에서 S의 카우 정자. 우리 연구소는 현재이 점을 해결하기 위해 다양한 샘플링 시간 후 수집 된 정 세관 세포와 마미 정자에서 유도 MFS을 비교한다. 우리는 OECD 가이드 라인은 또한 생식 세포 분석에 적합 할 수있는 간 천천히 나누어 조직에 대한 이십팔일의 다른 샘플링 시간을 알 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이용 가능한 데이터는 여전히 불충분하고, 우리는 체세포 규제 테스트 TGR 돌연변이 분석을 이용한 생식 세포의 동시 분석에 대한 한 번의 실험 설계를 추천 현재 없습니다. 주목해야이 분석의 하나의 특성은 돌연변이 사건이 아닌 뮤린 트랜스에 평가된다는 점이다. 그러나, 도입 유전자가 내생 유전자 20과 유사한 방식으로 환경 돌연변이에 응답하는 것을 제안 할 수있는 충분한 증거가있다. 또한, 독립적 인 돌연변이 때문에 이벤트의 정확한 기원하기 어려운해결 한 결과는 일반적으로 (a 돌연변이 빈도에 대비하여) 돌연변이 빈도로보고되어있다. 결과는 DNA 염기 서열에 의해 (유전자 돌연변이의 관측 주파수에 기여할 수있는 하나의 돌연변이 세포의 예. 분열과 곱셈) 클론 확장을 수정하는 경우 실제 돌연변이 주파수는 해결할 수 있습니다. 이것은 시간과 비용의 분석에 크게 추가하더라도 돌연변이 유전자의 염기 서열은 lacZ의 돌연변이를 특성화하고, 클론 확장 이벤트로부터 유도 될 수있다 돌연변이를 확인하기 위해 수행 될 수있다. 짧은 (294 3,021 염기쌍의 lacZ VS BP,도 1) 및 29 서열 쉽다 λ의 CII 유전자의 변이체의 lacZ 유전자 외에도 theλgt10 형질 전환 벡터는 다른 온도에 따라 돌연변이 리포터 유전자를 항구. 시퀀싱 또한 mutatio에 대한 통찰력을 제공 유도 돌연변이 스펙트럼의 분석을 허용당해 화합물의 NAL기구. 클론 확장의 극단적 인 예는 &quot;대성공&quot;돌연변이의 발생 (즉., 형질 전환 유전자 극적으로 상승 MF에 기여하는 기관의 발전의 초기 단계에서 돌연변이, 때로는 수백 배경보다 수천 배까지). &quot;잭팟&quot;돌연변이 동물 또는 조직 분석에서 제거해야합니다. 우리가 기술 한 분석은 (20에서 검토) 유사한 돌연변이 기자 벡터 항구 모두 BigBlue 마우스와 쥐, 그리고 lacZ의 플라스미드 마우스와 같은 다른 TGR 모델에 광범위하게 적용 할 수있다. 유사한 방법을 사용 날짜에 실시 생식 세포 연구의 대부분은 ENU와 (30에서 검토) 방사선 거의 독점적에 잘 특징 돌연변이를 초점을 맞추고있다. 이 TGR 분석에 대한 OECD 테스트 가이드 라인의 최근 발표와 함께이 분석 될 것으로 예상된다화학 물질 심사 및 규제 평​​가를 위해 점점 더 인기. 규제 시험 전지에 TGR 생식 세포 돌연변이 분석의 혼입 생식 세포 (11)에 유도 된 돌연변이의 효율적인 평가를 허용함으로써 기존의 갭을 채울 것이다. 또한,이 분석은 동일한 유전 끝점 환경 에이전트 돌연변이 유도에 체세포 및 생식 세포의 상대 감도를 비교하기위한 적절한 수단을 제공하고, 거의 모든 조직에서 MF를 측정하는데 사용될 수있다.

생식 세포에서 산발적 인 DNA 변이는 감소 생식 성공으로 이어질 수 있고, 상속 된 경우 자손 1-3 암 유전 질환이나 높게 경향의 원인이 될 수 있습니다. 실질적인 증거 드 노보 돌연변이의 큰 비율 부계 생식선 4로부터 상속 함을 입증하고 자손 돌연변이 수가 긍정적 개념 5시 아버지 나이와 상관된다. 남성 돌연변이의 높은 비율은 성별과 배우자 형성시 연령의 차이의 결과로 여겨지고, 여성 생식계 2 oogenic 세포 분열의 수와 비교하여 정자 세포 분열의 더 큰 수와 DNA의 진보적 쇠퇴 남성의 연령 효율을 복구 할 수 있습니다. 이러한 모든 요인은 남성 생식 계열 6의 복제 에러 확률의 증가에 기여한다. 그러나 부계 노출의 영향 ENVIRO 할드 노보 돌연변이의 빈도에 nmental 요인은 불확실하다. 그럼에도 불구하고, 환경 다수의 에이전트가 설치류 7의 생식 세포 돌연변이를 유도하는 것으로 알려져 있으며, 이들 제제의 일부는 인간 생식 세포계 8에 영향을 미칠 수 있다는 증거가 장착되어있다. 이러한 우려에도 불구하고, 화학 물질에 일상적으로 규제 목적으로 체세포 돌연변이를 유도 할 수있는 능력을 테스트하고는 일반적으로 신체 검사가 생식 세포를 보호하기에 충분하다는 것을 가정한다. 따라서 화학 물질은 거의 생식 세포 돌연변이를 유도 할 수있는 능력에 대한 평가가 없습니다. 이유 중 하나는 생식 세포 변이원성 시험은 주로 규제 의사 결정 과정에서 생략 된 것은 실제적인 방법론의 부족이다. 이러한 지배적 인 9 치명적인 특정 궤적 (10) 검사와 같은 전통적인 설치류 기반의 방법은 배아 또는 자손에서 돌연변이 표현형을 득점하여 생식 세포 돌연변이 비율을 추정노출 부모. 이러한 분석법은 통계적으로 의미있는 결과를 얻기 위해 동물들, 시간 및 리소스를 매우 많은 수의 사용을 필요로한다. 생식 세포 돌연변이를 정량화하기위한 여러 방법들이 현대 최근 등장 하였지만, 많은 자신의 실용성, 효율성 및 생체 적합성의 관점에서 단점을 겪는다. 예를 들어, 확장 간단한 탠덤 반복 (ESTR) 유전자 좌에서 길이 변이를 반복하는 단일 분자 PCR 방법 (15)을 사용하여 남성 생식 세포 정량화 할 수있다. 그러나,이 방법의 실행은 기술적으로 어렵고 힘든 일 수 있으며, 점 돌연변이는 달리, 매우 불안정한 ESTR 궤적의 반복 길이의 변화와 건강 생물학적 중요성은 명확 16 남아있다. 유전성 돌연변이 4,17의 문제에 적용 할 때 도시 전체 게놈 시퀀싱 기술은 생물학적으로 의미있는 풍부한 데이터를 제공 할 수 있지만, 높은 비용, 높은 에러율은 연관된 유효성 필요돌연변이를 확인하고, 생물 정보학 문제는 여전히 규제 테스트 용량 (18)이 옵션의 일상적인 적용을 제한합니다. 여기서, 우리는 유전자 변형 수컷 쥐의 생식 세포에서 직접 유발 돌연변이를 정량화하기위한 실제적인 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 3 번 염색체 19 (도 1)의 두 복사본에 통합 대장균의 lacZ 리포터 유전자를 함유하는 재조합 λgt10 파아지 벡터의 다수의 사본을 가지고 연결된 형질 MutaMouse 모델에 대해 설명한다. 이 프로토콜은 또한 동일한 원칙 (BigBlue 마우스와 쥐, 또는 lacZ의 플라스미드 마우스, 등.) 또는 약간 다른 리포터 유전자 (GPT 델타 마우스와 쥐를 기반으로 다른 형질 전환 쥐 (TGR) 모델과 관련, TGR 모델은 램버트 등 검토 알. 20). 이 방법은 최근 발표에 설명 TGR 돌연변이 분석에 기초및 OECD 테스트 가이드 라인 (21)을 개정 우리는 때문에 정자의 고유 한 특성의 남성 생식 세포에 돌연변이의 평가를 수용하기 위해 필요한 특수 고려 사항에 자세히 설명. 간단히, 분석은 사전 돌연변이 병변이 안정 돌연변이로 고정 샘플링 시간 다음에 돌연변이 유발 물질 유전자 변형 수컷 생쥐를 노출 포함한다. 선택된 샘플링 시간에, 마우스를 안락사와 생식 세포가 카우의 부고환 또는 정 세관 하나에서 수집된다. 후술하는 바와 같이, 정자 형성의 서로 다른 단계에서의 돌연변이 유발 효과는 노광 및 샘플 수집 간격을 선택함으로써 결정될 수있다. 셀 당 λ 파지 게놈의 여러 복사본을 포함하는 형질 전환 인서트는, 생식 세포 게놈 DNA를 분리 한 후 E.를 감염하는 데 사용되는 감염성 λ 파지 입자를 만드는 빈 λ 파지의 캡시드로 포장되어 대장균 호스트. 감염된 박테리아는 SELEC에 재배야생형의 lacZ를 형질 세포의 lacZ의 돌연변이 된 복사본 벡터를 함유하는 세포를 구분할 수 TIVE 매체. 남성 생식 세포에 노출 돌연변이 유발 효과 (램버트 외. 20에서 검토도 2) 제어 및 처리 마우스 사이의 유전자 돌연변이의 빈도를 비교하여 결정된다. 세균 세포의 많은 수의 요구되는 동물의 수를 감소시키면서, 기존의 방법에 비해이 분석 우수한 감도를 제공 한 마우스에서 정량 할 수있다. 더 전문적인 장비 나 교육이 필요하지 않습니다 때문에,이 분석은 가장 현대적인 독성 / 분자 생물학 실험실에서 생식 세포 돌연변이 테스트를위한 실용적이고 효율적인 옵션을 제공합니다. TGR 생식 세포 돌연변이 분석의 효과적인 적용을위한 하나의 필수 요구 사항은 정자 사이클 (그림 3)에 대한 이해이다. 성에서 진행하는 마우스 생식​​ 세포에 대한 시간마지막으로 정조 세포, 정모 세포, 정자, 그리고에 정 세관에서 전각 세포 (예. 정자)이 약 사십구일입니다 부고환에서 정자를 성숙. 돌연변이는이 사이클의 다양한 단계에서 발생하고 종종 화합물 특정 할 수 있습니다. 남성 생식 세포에 돌연변이에 특히 관련이있는 두 가지 핵심 기능은 초기 감수 분열시 DNA 합성의 중단, 늦은 후 감수 분열시 DNA 수리 능력 (6)의 진보적 인 손실의 유도와 고정에 필요한 두 개의 프로세스 아르 대부분의 돌연변이. 정자 때문에 이러한 독특한 특성, TGR 생식 세포 돌연변이 분석의 수행을위한 세 가지 중요한 실험 변수가있다 : (1) 시험 화합물의 투여 시간; (2) 샘플링 시간; 및 (3) 생식 세포 집단의 선택은 분석 (도 3 및 표 1)에 대해 수집. 투여 시간이다 experime긴 대상 세포를 시험 화합물에 노출되는 방법을 결정 ntal 변수. 투여 시간의 길이는 특정 세포 유형 또는 정자 형성의 단계에 노출을 타겟팅하는데 사용될 수있다. 예를 들어, 하루의 투여는 특정 세포 유형에 대한 급성 노출 효과를 결정하기 위해 사용될 수있다. 마찬가지로 노출은 meiotically 분할 정모 세포를 표적으로하거나 mitotically 이주 투여 시간 및 적절한 샘플링 시간 정조 세포를 이용하여 분할함으로써, 예를 들면, 전체 정자 상에 집중 될 수있다. 만성 및 하위 만성 투여 시간은 시험 화합물의 충분한 약물 동력학 분포를 확보, 또는 28 일의 투여 시간은 OECD 시험에서 추천 예 약함 돌연변이에서 돌연변이 충분한 축적 (허용, 장기 노출의 효과를 평가하는 데 사용 가이드 라인). 샘플링 시간을 결정하는 중요한 변수되는정자의 위상은 표적 세포는 노광시에 있었다. 샘플링 시간은 얼마나 많은 시간을 지시, 따라서 얼마나 더 정자 사이클을 따라, 세포는 노출 후 통과합니다. 예를 들어, 줄기 세포 정조 세포에 미치는 영향을 조사하기 위해, 샘플링 시간&gt; 사십구일은&gt; 사십이일 완전히 성숙 된 정자를 수집하는 경우에는 필요, 또는 수집 된 모든 세포에 충분한 시간이 있는지 확인하기 위해 정 세관에서 미​​성숙 생식 세포를 수집하는 경우 노출에서 개발은 줄기 세포를. 이것은 적어도 70 일의 샘플링 시간이 정자 이후 단계에서 노출 세포의 제거를 위해, 독성 물질의 약물 동력 학적 분포를위한 충분한 시간을 제공하는 진정한 줄기 세포 효과를 입증하는 것이 바람직 할 것이며, 고려하여주의하는 것이 중요 높은 돌연변이 유발 물질에 노출 된 후 22 ~ 육주를 발생할 수 있습니다 일시적 불임의 기간. 비슷하게 21 일의 샘플링 시간은 정자 이거를 보장 할마미의 부고환에서 cted은 노출의 마지막 날 감수 분열을 완료 한 것입니다. 생식 세포는 카우의 부고환에서, 또는 정 세관에서 다양 정자 세포 유형의 혼합물로서 성숙한 정자로서 수집 될 수있다. 성숙한 정자 상대 정확도 정자 주어진 실험 설계를 위해 시작된 정자 세포 유형 또는 위상으로 결정하는 것을 가능하게 ~ 3 일간 카우 남아있다. 따라서, 카우 정자 허가의 분석은 높은 단계 특정 돌연변이 효과의 조사 대상. 한편, 정 세관에서 수집 된 세포 현탁액의 개발 단계에서 여러 가지 세균 세포 유형의 혼합물을 포함하고, 이와 같이 돌연변이 유래 된 정자의 불량한 위상 분해능을 제공한다. 또한, 정 세관 세포로부터 회수 현탁액 정모 세포 뒤에 정자의 과잉 표현, 및 버전을 포함하는 경향Y 몇 정조 세포 및 줄기 세포 (이 비율은 그림 3과를 졸업 흰색 막대로 표시됩니다). 또한, 정 세관에서 제조 된 현탁액은 다양한 체세포를 포함 할 수있다. 많은 세포 종류가 존재하기 때문에 이와 같이, 돌연변이 효과는 비 대상 세포의 종류에 의해 영향을받을 수있다. 그러나 정 세관에서 샘플을 수집하는 동시에 여러 생식 세포 유형 및 체세포 돌연변이에 대한 표준 OECD 시험 프로토콜에 생식 세포 분석의 쉬운 통합을 스크리닝 경제적 인 옵션을 제공합니다. 조사자, 투여 시간, 및 샘플링 시간 수집 세포 집단의 필요에 따라, 반복 다양한 세포 유형 및 정자 형성의 서로 다른 단계에서의 노출 효과를 심문하도록 조정될 수있다. 이러한 변수를 신중하게 선택함으로써, 실험, 또는 더 일반화 규제 시험 대상으로 역학적 연구를 위해 설계 될 수있다목적을 보내고. 분석에서 높은 점수를 얻기 위해, 우리는 70 일의 샘플링 시간 포지티브 제어 하였다 / kg N-에틸-N-니트로 소 우레아 100 mg의 (ENU)의 급성 경구 투여에의 사용을 추천한다. 카우 정자의 분석은 따라서 일반적으로 ENU이 높은 돌연변이 용량 다음과 같은 컨트롤을 통해 돌연변이 주파수 (MF)의 4 ~ 5 배 증가를 전시 정원 줄기 세포 (그림 3)를 대상으로합니다. 이는 따라서 짧은 샘플링 시간에 대한 적절한 도즈 제어되지 않을 수도 선량이 무균 6주 노광을 게시 유도하는 것으로 알려져 있음에 유의해야한다. 이 용량은 대부분의 신체 조직 20 MF에서 검출 증가를 생성합니다. 아래에 제시 대표 결과 및 100 ㎎ / ㎏을 포함하여 ENU의 세 가지 용량을 사용하여 급성 70 노출 요법 다음 생성 된.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1326">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:664px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MutaMouse</td>
			<td>Covance</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">E.coli (lacZ-/galE-)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:664px;">See reference 25 in manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>3001-2-40</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (D-PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-250</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5M, pH 8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03690 FLUKA</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>2/10/7900</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lennon LB broth base</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12780-029</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel mesh filter</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3770</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transpack packaging extract</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200220</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH)</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Ampicilin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11593-027</td>
			<td style="width:664px;">prepare 20 mg/ml in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815-024</td>
			<td style="width:664px;">prepare 5 mg/ml in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15509-097</td>
			<td style="width:664px;">Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenyl-&#946;-D-galactopyranoside (P-Gal)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6501</td>
			<td style="width:664px;">dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530-031</td>
			<td style="width:664px;">prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 &#181;l per sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate (NaAc)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td style="width:664px;">prepare 3M solutution, pH 5.2</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4390</td>
			<td style="width:664px;">prepare 10% solution in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">1 M MgSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">24.6 g MgSO4&#183;7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">20% maltose solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">20.0 g maltose, 24.6 g MgSO4&#183;7H2O, per 100 ml dH2O, filter sterilize, sore at 4&#7506;C up to 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Bottom agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">Prepare 64 ml per sample (8 pitri plates per sample X&#160; 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50&#7506;C before pouring into Petri plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1L dH2O. Autoclave and cool</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saline sodium citrate (SSC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;">SM Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4&#183;7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Top agar, mutant plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50&#7506;C. Add MgSO4 to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Top agar, titre plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L H2O. Autoclave and cool to 50&#7506;C. Add MgSO4 to 10 mM and P-Gal to 3 g/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transgenic rodent assay for quantifying male germ cell mutant frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

동물 당 200,000 플라크 평균 플라크 카운트, 우리는 일반적으로 우리 대조군에서 1.7 × 10 -5, 표준 편차는 약 2.8 × 10 -5 수컷 생식 세포에서의 평균 배경 MF 관찰 (독립 팔 데이터에 기초 실험). N = 5 동물이 플라크 수, 배경 수준과 분산, 투여 그룹과 각 전원&gt; 0.8와 MF의 2 배의 증가를 감지하기에 충분하다. 결과는 일반적으로 표 2와 그림 6은 공의 단일 급성 경구 투여, 25, 50에 노출 MutaMouse 남성의 카우 정자 (그룹 당 n = 5)에서 대표적인 결과를 보여줍니다. 표 또는 그래픽 형식으로보고하고, 100 ㎎ / ㎏ 아르 70 일의 샘플링 시간이어서 N-에틸-N-니트로 소 우레아 (ENU). 이 칠십일 기간은 노광시의 정원 줄기 세포가 있었다 정자 발생 돌연변이 사건의 측정 (도 3을 허용). 돌연변이 및 역가 플레이트에 플라크 전형적인 밀도가도 7에 도시된다. 표 2 및도 6에 도시 된 바와 같이, 급성 ENU 노출은 정원 줄기 세포의 MF에서 용량 의존적으로 유의 한 증가를 유도. 낮은 복용량은 2.6 × 10 -5의 기준 MF했다 컨트롤을 통해 상당한 2.6 배 증가를 유도. 최대 유도 제어에 비해 4.4 배 증가를 유도 높은 복용량에서 발생했습니다. 정소 세관 생식 세포에서 수행이 분석의 예는 더글라스 외. 27 MF가 / kg ENU 50 mg을 오일 반복 복강 내 주사 다음 다양한 시간 간격 세뇨관 세균 세포에서 측정 하였다에서 찾을 수있다. 이 연구에서, 정액을 운반하는 세포에서 돌연변이 주파수는 치료 후 15 일까지 증가하고 그 이후 일정하게 유지되었다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr tr=""><td> 엑스포확인 요법 </td><td> 수집 된 조직 </td><td> 수집 된 세포 유형 (타겟 셀) </td><td> 노출의 처음에 타겟 셀의 위상 </td><td> 단계 노출시 전달 </td></tr><tr><td> 급성 + 70 </td><td> 카우 </td><td> 성숙한 정자 </td><td> 줄기 세포 </td><td> 줄기 세포 </td></tr><tr><td> 14 + 21 </td><td> 카우 </td><td> 성숙한 정자 </td><td> 정조 세포 </td><td> Spermatid </td></tr><tr><td> 14 + 35 </td><td> 카우 </td><td> 성숙한 정자 </td><td> 줄기 세포 </td><td> Spermatocyte </td></tr><tr><td> 28 + 3 </td><td> 카우 </td><td> 성숙한 정자 </td><td> Spermatocyte </td><td> Spermatocyte Spermatid 성숙한 정자 </td></tr><tr><td></td><td> 세관 </td><td> 줄기 세포 </td><td> 줄기 세포 </td><td> 줄기 세포 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 정조 세포 </td><td> SPermatogonia </td><td> 정조 세포 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Spermatocyte </td><td></td><td> Spermatocyte </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Spermatid </td><td></td><td> Spermatid </td></tr><tr><td> 28 + 49 </td><td> 카우 </td><td> 성숙한 정자 </td><td> 줄기 CEL </td><td> 줄기 세포 </td></tr><tr><td></td><td> 세관 </td><td> 줄기 세포 정조 세포 Spermatocyte Spermatid </td><td> 줄기 세포 </td><td> 줄기 세포 </td></tr></tbody></table> 다양한 실험 설계에 의한 형질 전환 쥐의 돌연변이 분석의 대상이되는 표 1 셀 유형과 정자의 단계. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 투여군 </td><td> 동물 # </td><td> 돌연변이 PFU </td><td> 총 PFU </td><td> MF (배10 -5) </td><td> 평균 MF (× 10 -5) </td><td> 배 변경 </td><td> P 값 </td></tr><tr><td> 제어 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 180245 </td><td> 2.8 </td><td> 2.6 </td><td> 1.0 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 이 </td><td> 4 </td><td> 137835 </td><td> 2.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3 </td><td> 11 </td><td> 385672 </td><td> 2.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4 </td><td> 이 </td><td> 431396 </td><td> 0.5 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 152413 </td><td> 3.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 25 mg을 / kg </td><td> 6 </td><td> 17 </td><td> 162353 </td><td> 10.5 </td><td> 6.9 </td><td> 2.6 </td><td> 0.0002 </td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td> 14 </td><td> 150094 </td><td> 9.3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 8 </td><td> 4 </td><td> 154401 </td><td> 2.6 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 9 </td><td> 9 </td><td> 154401 </td><td> 5.8 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10 </td><td> 12 </td><td> 196978 </td><td> 6.1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 mg을 / kg </td><td> 11 </td><td> 17 </td><td> 155727 </td><td> 10.9 </td><td> 9.3 </td><td> 3.6 </td><td> &lt;0.0001 </td></tr><tr><td></td><td> 12 </td><td> 11 </td><td> 135847 </td><td> 8.1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 13 </td><td> 25 </td><td> 193499 </td><td> 12.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 14 </td><td> 12 </td><td> 133859 &lt;/ TD&gt; <td> 9.0 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 15 </td><td> 14 </td><td> 252807 </td><td> 5.5 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100 ㎎을 / kg </td><td> 16 </td><td> 26 </td><td> 170968 </td><td> 15.2 </td><td> 11.5 </td><td> 4.4 </td><td> &lt;0.0001 </td></tr><tr><td></td><td> 17 </td><td> 28 </td><td> 234584 </td><td> 11.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 18 </td><td> 10 </td><td> 145289 </td><td> 6.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 19 </td><td> 35 </td><td> 292236 </td><td> 12.0 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 20 </td><td> 22 </td><td> 190848 </td><td> 11.5 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 표 2 형질 전환 남성 m의 카우 정자의 lacZ의 돌연변이 주파수그들은 정원 줄기 세포 (= 일일 관리 시간, 샘플링 시간 = 칠십일) 일 때 얼음 ENU에 심하게 노출. PFU는 플라크 형성 단위, MF = 돌연변이 주파수를 =. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig1highres.jpg" /> 도 1 λgt10 파아지 구조의 개략도. <img alt="그림이" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig2highres.jpg" /> 그림 2 형질 전환 쥐의 생식 세포 돌연변이 분석의 개요. <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig3highres.jpg" /> 도 3 및 마우스에서 정자 세포 유형과 같은 PHA의 개략도다양한 실험 설계에 의한 형질 전환 쥐의 돌연변이 분석의 대상이 아르 에스 주 :.. 졸업 흰색 막대는 정 ​​세관에서 제조 된 세포 현탁액에 존재하는 세포 유형 (즉, 정자&gt; 정모 세포&gt; 정조 세포&gt; 줄기 세포)의 상대적 비율을 나타내는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51576/51576fig3highres.jpg" target="_blank">하세요 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig4highres.jpg" /> 마우스 마미의 부고환의 4 컬렉션을줍니다. A)) 음낭. B 방향으로 복부 절개를 부드럽게 고환과 부고환을 그립니다 지방 패드를 당겨) 부고환 지방 패드. C를 확인합니다. D) 찾아 마미의 부고환을 절제. 정 세관에서 생식 세포의 현탁액 (5) 준비 그림. A) 절개에 5 ~ 10 ° 각도로 정 세관은 캡슐. C) 조직 롤러가 부드럽게 세관을 통해 전달의 압박이있는 정 세관. B)를 노출 고환의 상피 캡슐에서 이루어집니다 . D에 포함 된 생식 세포) 생식 세포 현탁액을 추가 처리를 위해 수집을 놓습니다. <img alt="그림 6" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig6highres.jpg" /> MutaMouse 정자에서의 lacZ 돌연변이 주파수의 그림 6 그래픽 표현 (N = 5) ENU에 줄기 세포로 급성 노출. 각삼각형은 한 동물의 MF를 나타냅니다. * P &lt;0.05 포아송 회귀 분석에 의해 결정. <img alt="그림 7" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig7highres.jpg" /> 플라크와 형질 전환 쥐의 돌연변이 분석에서 그림 7 대표 한천 플레이트는 E.의 잔디밭에 형성 콜라이 숙주 박테리아. A) &quot;돌연변이&quot;판은 가끔 어떤 접시에 제로 플라크. B) &quot;역가&quot;판 플라크의 수백을 가질 수있을 것이다 특히 제어 투여 그룹에서 화살표로 표시된 거의 플라크 ()를,해야합니다.

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Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

형질 전환 쥐 분석 정량화 남성 생식 세포 돌연변이 주파수에 대한

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.1K 조회수.  Environmental Health Centre. De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

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Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

쥐 Neonates에서 기본 Dissociated Midbrain의 도파민 세포 문화

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

연구

생물학

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways. One of the hurdles to its understanding has been the varied methods in correlating changes of key signaling events to differentiation efficiency. We describe here the use of a mouse embryonic stem (ES) cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. By scoring for contracting embryonic bodies (EBs) in a 96-well plate format, we can quickly quantify cardiogenic efficiency and identify crucial time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation in a time course following specific modulator treatments. The principal outlined here is not limited to cardiac induction alone, and can be applied towards the study of many other cell lineages. In addition, the 96-well format has the potential to be further developed as a high throughput, automated assay to allow for the testing of more sophisticated experimental hypotheses.

We describe the use of a mouse ES cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&#946;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. The method provides a standardized platform that reliably quantifies cardiogenic efficiency, and it is applicable to the study of other cell lineages.

Cardiogenic 유도 효율을 Quantifying에 대한 수정 마우스 배아의 줄기 세포 기반 어세이

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

Syngeneic Zebrafish의 제한 희석 세포 이식을 사용하여 종양 - 증식 세포의 주파수 Quantifying

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies showed that microinjection of germ cells from fertile donor mice into the seminiferous tubules of infertile recipient mice results in donor-derived spermatogenesis and sperm production by the recipient animal2. The use of donor males carrying the bacterial &beta;-galactosidase gene allowed identification of donor-derived spermatogenesis and transmission of the donor haplotype to the offspring by recipient animals1. Surprisingly, after transplantation into the lumen of the seminiferous tubules, transplanted germ cells were able to move from the luminal compartment to the basement membrane where spermatogonia are located3. It is generally accepted that only SSCs are able to colonize the niche and re-establish spermatogenesis in the recipient testis. Therefore, germ cell transplantation provides a functional approach to study the stem cell niche in the testis and to characterize putative spermatogonial stem cells. To date, germ cell transplantation is used to elucidate basic stem cell biology, to produce transgenic animals through genetic manipulation of germ cells prior to transplantation4,5, to study Sertoli cell-germ cell interaction6,7, SSC homing and colonization3,8, as well as SSC self-renewal and differentiation9,10.
Germ cell transplantation is also feasible in large species11. In these, the main applications are preservation of fertility, dissemination of elite genetics in animal populations, and generation of transgenic animals as the study of spermatogenesis and SSC biology with this technique is logistically more difficult and expensive than in rodents. Transplantation of germ cells from large species into the seminiferous tubules of mice results in colonization of donor cells and spermatogonial expansion, but not in their full differentiation presumably due to incompatibility of the recipient somatic cell compartment with the germ cells from phylogenetically distant species12. An alternative approach is transplantation of germ cells from large species together with their surrounding somatic compartment. We first reported in 2002, that small fragments of testis tissue from immature males transplanted under the dorsal skin of immunodeficient mice are able to survive and undergo full development with the production of fertilization competent sperm13. Since then testis tissue xenografting has been shown to be successful in many species and emerged as a valuable alternative to study testis development and spermatogenesis of large animals in mice14.

Protocols for germ cell transplantation and testis tissue xenografting are described. Germ cell transplantation results in donor-derived spermatogenesis in recipient testes and represents a functional reconstitution assay for identification of spermatogonial stem cells (SSCs). Testis tissue xenografting reproduces testis development and spermatogenesis of various donor species in recipient mice.

배아 세포 이식 및 Testis 조직 마우스에 Xenografting

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell migration, gene expression, cell cycle progression and cell adhesion 1. Rho proteins are molecular switches that are active in GTP-bound and inactive in GDP-bound state. Their activation is mediated by a family of Guanine-nucleotide Exchange Factor (GEF) proteins. Rho-GEFs constitute a large family, with overlapping specificities 2. Although a lot of progress has been made in identifying the GEFs activated by specific signals, there are still many questions remaining regarding the pathway-specific regulation of these proteins. The number of Rho-GEFs exceeds 70, and each cell expresses more than one GEF protein. In addition, many of these proteins activate not only Rho, but other members of the family, contributing further to the complexity of the regulatory networks. Importantly, exploring how GEFs are regulated requires a method to follow the active pool of individual GEFs in cells activated by different stimuli. Here we provide a step-by-step protocol for a method used to assess and quantify the available active Rho-specific GEFs using an affinity precipitation assay. This assay was developed a few years ago in the Burridge lab 3,4 and we have used it in kidney tubular cell lines 5,6,7. The assay takes advantage of a "nucleotide free" mutant RhoA, with a high affinity for active GEFs. The mutation (G17A) renders the protein unable to bind GDP or GTP and this state mimics the intermediate state that is bound to the GEF. A GST-tagged version of this mutant protein is expressed and purified from E. coli, bound to glutathione sepharose beads and used to precipitate active GEFs from lysates of untreated and stimulated cells. As most GEFs are activated via posttranslational modifications or release from inhibitory bindings, their active state is preserved in cell lysates, and they can be detected by this assay8. Captured proteins can be probed for known GEFs by detection with specific antibodies using Western blotting, or analyzed by Mass Spectrometry to identify unknown GEFs activated by certain stimuli.

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

The method presented here describes an assay to follow activation of RhoA specific GDP/GTP Exchange Factors (GEFs) in cultured cells by making use of a mutant RhoA GST fusion protein that has high affinity for activated GEFs. GEFs are precipitated from cell lysates, detected by Western blotting and quantified by densitometry.

상피 세포 Lysates에서 GST-태그가 돌연변 Rho 단백질을 (GST-RhoA (G17A))를 사용하여 활성 Rho-GEFs의 친화력 강수량

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell ...

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous tubules of the testes. Currently, there is no reliable cell culture system allowing for spermatogenic differentiation in vitro, and most biological studies of spermatogenic cells require tissue harvest from animal models like the mouse and rat. Because the testis contains numerous cell types - both non-spermatogenic (Leydig, Sertoli, myeloid, and epithelial cells) and spermatogenic (spermatogonia, spermatocytes, round spermatids, condensing spermatids and spermatozoa) - studies of the biological mechanisms involved in spermatogenesis require the isolation and enrichment of these different cell types. The STA-PUT method allows for the separation of a heterogeneous population of cells - in this case, from the testes - through a linear BSA gradient. Individual cell types sediment with different sedimentation velocity according to cell size, and fractions enriched for different cell types can be collected and utilized in further analyses. While the STA-PUT method does not result in highly pure fractions of cell types, e.g. as can be obtained with certain cell sorting methods, it does provide a much higher yield of total cells in each fraction (~1 x 108 cells/spermatogenic cell type from a starting population of 7-8 x 108 cells). This high yield method requires only specialized glassware and can be performed in any cold room or large refrigerator, making it an ideal method for labs that have limited access to specialized equipment like a fluorescence activated cell sorter (FACS) or elutriator.

The STA-PUT method allows for the separation of different populations of spermatogenic cells based on size and density.

STA-PUT 속도의 침전을 사용하여 정자 형성 세포 유형의 분리

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

해부, 이미징 및 약물 학적 치료 : 초파리의 번데기 고환 및 단일 남성 생식 줄 낭종의 생체 내 문화

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

형질 전환의 세대<em&gt; 히드라</em&gt; 배아 미세 주입에 의해

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Screenable<em&gt; 생체</em&gt; 형질 전환 발광 생물을 사용 미토콘드리아 변조기에 대한 분석<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

매체-처리량에 캘리포니아2 +효과의 평가 대 한 분석 실험을 심사-신호 및 인간의 정자에서 Acrosome 반응

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...