이 방법은 야생 Caenorhabditis 선충에서 발견되는 새로운 미생물의 농축 및 식별을 용이하게하여 숙주 미생물 상호 작용에 대한 추가 조사를 가능하게 했습니다. 이 기술의 주요 장점은 연구자가 야생 선충의 장에서 직접 비 컬터블 병원균 및 미생물군유전체 박테리아를 풍부하게 할 수 있다는 것입니다. 관심의 헤아릴 수 없는 미생물로 선충의 야생 Caenorhabditis 균주를 얻고 식품 원으로 OP51 에슈리치아 대장균을 포함하는 표준 선충 성장 매체 또는 NGM 플레이트에 벌레를 성장시킴으로써 시작합니다.
모든 OP51 에슈리치아 대장균이 소비되고 대부분의 벌레가 Dauer 단계에 도달할 때까지 20도에서 4~5일 동안 선충을 배양합니다. Dauer 단계에서 선충을 세척하려면 M9 최소 소금 미디어 5 밀리리터를 굶주린 벌레 6센티미터 플레이트에 추가하고 멸균 유리 파이펫과 전구를 사용하여 플레이트에서 M9 미디어와 웜을 피펫하고 멸균 15 밀리리터 원심분리기로 이송합니다. 실온에서 30초 동안 1, 000회 G에서 벌레를 회전한 다음, 벌레 위에 약 50마이크로리터의 M9를 방치하여 살아있는 벌레를 방해하지 않고 멸균 15 밀리리터 파이펫을 사용하여 벌레펠릿 위에 M9 상체를 제거하고 폐기하십시오.
동일한 원심분리기 튜브에 트리톤 X-100의 0.05%를 포함하는 M9 매체의 10밀리리터를 추가하고 튜브의 캡을 적절하게 조여 실내 온도에서 누타에 튜브를 배치하여 외부 미생물을 제거합니다. 누테이터에서 20분 동안 잠복한 후 실온에서 30초 동안 1, 000배 G로 웜을 회전한 다음, 시연된 대로 M9 슈퍼네티티를 제거하고 폐기하고 트리톤 X-100의 0.05%를 함유한 M9 미디어를 통해 세 번 세척 절차를 반복합니다. 다음으로, 새로 준비된 항생제 및 SDS 용액을 추가하여 실온에서 누테이터에서 하룻밤 동안 선충을 함유한 튜브를 배양한다.
항생제로 치료 한 후, 실온에서 1 분 동안 1, 000 배 G에서 튜브의 벌레를 회전시십시오. 0.05%트리톤 X-100을 함유한 M9의 10밀리리터를 추가하기 전에 상퍼를 제거하고 캡을 적절하게 조여 실온에서 20분 동안 누테이터에 튜브를 배양합니다. 완료되면 1분 동안 1, 000회 G에서 웜을 회전시키고 이 절차를 세 번 반복합니다.
0.05%트리톤 X-100을 함유한 M9로 네 번째 세척 후, 100마이크로리터의 용액에 방해받지 않고 벌레 펠릿을 방치하고 나머지는 폐기한다. OP51 에슈리치아 대장균으로 시드된 10센티미터 NGM 플레이트의 중심으로 상수및 펠릿의 100마이크로리터를 전달한다. 다우어스가 중앙과 OP51 잔디밭을 5-10분 동안 기어나가는 동안 접시가 방해받지 않고 건조하도록 합니다.
조심스럽게 하나의 Dauer를 선택하고 OP51시드 6 센티미터 NGM 플레이트에 접시. 같은 방법으로 OP51로 시드된 개별 6센티미터 NGM 플레이트에서 최소 10개의 다이어플레이트가 있습니다. 다이어스가 성장하고 다음 세대 F1이 성인 단계에 도달 할 때까지 섭씨 20도에서 4 ~ 5 일 동안 플레이트를 배양 한 다음 모든 플레이트의 오염을 시각적으로 확인하십시오.
각 깨끗한 플레이트에 대해, 관심의 표현형에 따라 노마르스키 또는 형광 현미경 검사를 통해 관심있는 미생물의 전파를 확인합니다. 벌레를 굶주리고 OP51 박테리아의 수를 줄이려면 선충을 섭씨 20도에서 3~4일 동안 배양합니다. M9 매체의 밀리리터 5기를 최근 굶주린 벌레의 접시에 추가한 다음 M9 미디어와 웜을 멸균 15mm 원심분리기 튜브로 옮겨 실온에서 30초 동안 1, 000배 G로 회전합니다.
20 분 동안 누에이터에 0.05 %트리톤 X-100을 포함하는 M9의 10 밀리리터로 벌레를 5 번 세척하기 전에 상체를 제거하십시오. 마지막 세척 후, 용액의 100 마이크로 리터에서 펠릿을 방해하지 않고 상체를 제거하고 M9과 웜을 시드되지 않은 6센티미터 NGM 플레이트로 옮겨. 벌레가 20 분 동안 기어 다니는 동안 접시를 건조시켜 큐티클과 장에서 OP51을 제거하십시오.
플레이트가 건조하면 M9의 250 마이크로리터를 추가하고 웜을 새로운 시드되지 않은 6센티미터 NGM 플레이트로 이송하여 플레이트가 건조되는 동안 벌레가 기어갈 수 있도록 절차를 반복하십시오. 20분 후, M9의 마이크로리터 250개를 접시에 넣고 벌레와 함께 M9의 100마이크로리터를 깨끗한 시계 유리로 옮은 다음, 26게이지 주사기 바늘을 사용하여 선충을 참수한 다음, 벌레를 26 게이지 주사기 바늘로 내려 놓습니다. 일단 참수되면, 창자, 과립 질량 및 투명한 gonad는 선충 체에서 자연적으로 회피하고, 노출된 장의 조각을 잘라 내고 멸균물 10 마이크로리터를 포함하는 0.5 밀리리터 PCR 튜브로 전송합니다.
PCR 튜브에서 적어도 5 개의 다른 동물에서 내장을 수집하는 절차를 반복합니다. PCR 튜브를 섭씨 영하 80도에서 최소 5분간 동결합니다. PCR을 진행하기 전에 장 샘플을 해동하고 식별을 위해 시퀀싱합니다.
야생 Caenorhabditis 열대 균주 JU1848 방향 방식으로 장의 lumen을 식민지화 얇은 미생물을 가지고 있는 것으로 나타났습니다. 야생 균주 JU1848은 에체리치아 대장균 OP51 박테리아로 시드된 표준 6센티미터 NGM 플레이트에 눈에 띄는 미생물 성장을 전파했습니다. 청소 후, 단일 Dauer에서 F1 자손의 플레이트는 잠복 4 일 후 눈에 보이는 미생물 오염을 보여주지 않았다.
참수 된 JU1848 동물의 노마르스키 이미지에서, 식민지 박테리아는 선충 체 의 외부에 있는 장의 조각의 lumen에서 볼 수 있었다. 일부 Caenorhabditis 종은 Dauer 죽음을 방지하기 위해 낮은 SDS 농도를 요구할 수 있습니다. 깨끗한 선충 균주를 전파하려면 크롤링이 생존 오염 물질을 제거하는 데 도움이되기 때문에 중앙에서 가장 멀리 기어 다니는 Dauers를 선택하십시오.
