이 작품은 직원은 국립 드 라 공들인 (Jeunes Chercheuses / EFN에 Jeunes Chercheurs), 파운데이션 VOIR 등 Entendre과 파운데이션 Bettencourt SCHUELLER (EFN에 젊은 연구자 지원 사업), 센터 국립 드 라 과학원 (CNRS, EFN에 대한 영구적 인 위치)에 의해 지원되었다 및 (SCF에 R01-EY13295) 국립 보건원 (NIH)의 국립 안과 연구소. 또한, 문화원 드 라 비전은 연구소 국립 드 라 상테 등 드 라 공들인 MEDICALE, 대학 학자 피에르 등의 마리 퀴리 - 파리 6, 센터 국립 드 라 과학원과 부서 드 파리 재정 지원된다.

이 POS 분리 실험은 시간이 걸리고 POS 저장하기 전에 표시하는 경우 완료하는 데 12 시간까지 요구할 수있다. 프로토콜은 1997 10 SC Finnemann와 동료 1987 (31)에 RS Molday와 동료에 의해 ​​출판 및 수정 된 논문에서 적응하고있다. 동물은 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용을위한 비전 및 안과 (ARVO) 문 협회에 대한 연구에 따라 처리 하였다. 프로토콜을 검토하고 대학의 피에르와 마리 퀴리 - 파리 06에서 찰스 다윈 (Charles Darwin) 윤리위원회와 포드 햄 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 일반 설정까지 <ol><li> 가능한 도살 후 80 신선한 돼지 또는 소 눈 신선한 빨리 얻기과 어둠 속에서 냉장 보관하십시오. 이 회사는 같은 방식으로 진행 있도록 공급자에 대한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜은 (80)의 눈에 최적화되어 있습니다. 에더 눈을 진행하고 더 큰 주식을 얻을 수 (예를 들어, 160 눈에서) 솔루션 수량을 두 배로 초 원심의 2 라운드를 수행; 풀 샘플은 이후 단계에서 수집한다 (단계 2.2.2 참조). </li><li> 빨간색 안전 등 램프, 흡수 패드는 벤치에 설정, (재료 표)를 정리합니다. (... 유리체되지 않는 눈 부분) 15cm 요리와 생물 학적 가방 폐기물 수집을위한 준비. 꽉 끼는 labcoat, 장갑, 소매 보호 고글을 착용 할 것. </li><li> 주의 사항 : <ol><li> 모든 솔루션을 사전 진정 모든 단계에서 감기에 보관하십시오. 가능한 한 많은 얼음에 냉장 눈과 구배를 유지합니다. </li><li> 초 원심 분리 후 수집 단계는 시각적 안료 및 photopigments의 활성 형태의 오렌지 핑크 색상의 손실 photobleaching에 방지 할 때까지 가능한 한 많은 어둠 속에서 눈과 파생 조직을 유지합니다. </li></ol></li></ol> 2. 프로토콜 작업 <ol><li> 솔루션과 그라디언트를 준비합니다 <ol><li> 해동 타우린 주식은 완전히 37 ° C의 물을 욕조를 사용. </li><li> 원액의 모든 솔루션 (표 1, 재고 솔루션)를 준비하고 철저하게 각 솔루션에 대한 자기 교반기를 사용하여 다른 재료와 설탕을 섞는다. <ol><li> 20 % 수 크로즈의 최종 농도로 균질화 용액 15ml를 준비, 20 mM 중의 아세테이트 pH7.2 2 mM의 트리스의 MgCl 2, 10 mM의 포도당과 5 mM의 타우린. </li><li> (70 % 수 크로즈 스톡을 사용) 25 % 슈 크로스, 20 mM 트리스 아세트산의 pH 7.2, 10 mM의 포도당과 타우린 5mM의 최종 농도 25 % 수크로오스 용액을 제조 하였다. </li><li> (수크로오스 분말을 사용) 60 %의 자당 최종 농도 60 % 수크로오스 용액을 준비하는 20 mM 아세트산은 pH7.2, 10 mM의 포도당과 5 mM의 트리스 타우린. </li><li> 20 mM 트리스 아세트산의 pH 7.2 및 5mM의 타우린의 최종 농도로 세척 한 용액을 준비한다. </li><li> 세척이 솔루션을 준비합니다10 % 수 크로스, 20 mM 트리스 pH를 아세트산 7.2 및 5mM의 타우린의 최종 농도. </li><li> 10 % 수 크로스, 20 mM의 인산 나트륨 pH를 7.2 및 5mM의 타우린의 최종 농도 3 워시 용액을 준비. </li></ol></li><li> 자석 교반기에 그라데이션 메이커 꾸준한 60 % 용액이 삽입됩니다 출구에서 가장 가까운 챔버에서 교반 막대를 삽입합니다. 적절한 주조 속도를 달성하기 위해 튜브의 출구에 배치 된 차단 P200 피펫 팁을 사용한다. </li><li> 섬세 희석 및 사전 냉장 초 원심 분리기 튜브에서의 각 용액 (80 눈 즉, 총 6 튜브)를 사용하여 12 ml의 25 %로 한 60 % 수크로오스 용액을 교반하여 선형 그라디언트 캐스트. 잘 점차-희석 60 % 자당 솔루션을 저어. 너무 빨리 원활하지 용액 쏟아지는 구배 흐름의 속도를 정상. 주 : 연속, 선형 구배를 얻기 위해서는, 전체 오른쪽 그라데이션 상자 형성 용 용액의 표면에 피펫 팁 개구 유지N. </li><li> 그라디언트 안정화를 위해 약 1 시간 동안 얼음에 앉아 보자. 로드 될 때까지 냉각 구배를 유지합니다. 그라디언트의 중단을 방지하기 위해 튜브를 흔들지 마십시오. </li></ol></li><li> 조직 컬렉션 : <ol><li> 희미한 붉은 빛 아래 조직을 수집합니다. 한 손으로 눈을 타고 멀리 눈을 유지하면서 면도날의 가장자리에 전면을 찌를 (튀는 것을 방지하기 위해, 그림 1). 2 반 (각막 플러스 공막에 최소 5mm)로 전방 안구를 잘라 면도날을 사용합니다. 렌즈를 제거하고, 따라서 하나의 손가락이 망막의 노출 선단에 걸쳐 유지 될 수 있도록 뒤집어 아이 컵 플립. </li><li> 각도 면도날을 사용하여 쉽게 분리하고 부드럽게 tapetum 표면에서, 분홍빛 층으로서 나타나고 시신경 (도 1)에서 절단, 망막 긁어. 2 × 50 ㎖ 튜브 얼음에 균질화 용액 15 ml에 포함 된 각각의 모든 망막를 수집합니다. </li><li> 망막 호모genization : <ol><li> , 다른 세포 층을 방해 PR 세포, 조각 POS의 나머지 떨어져 POS 휴식과 망막 서스펜션을 균질화하기 위해 2 분 동안 손으로 적극적으로 서스펜션을 흔들어. </li><li> 깨끗한 거즈 이중층를 필터링 3X 큰 조직편을 제거하고 관류 깨끗한 50ml의 튜브 (도 1)에 수집한다. 망막 서스펜션은 부드럽게, 수율을 극대화 각 여과 후 남은 조각 조직을 해제 거즈에 눌러, 아주 두껍게. </li></ol></li></ol></li><li> 광 수용체 외부 세그먼트 조각 (POS) 분리 : <ol><li> 60 % 자당 그라데이션 (그림 1) - 30 × 6 이상 ML의 초 원심 분리기 튜브 신선한 냉장 연속 25의 각 포함한 24 ml의 튜브 당 7 ml의 - 부드럽게, 6 주위를 원유 망막 준비를하다. 로터가 사용될 수 있도록 적절한 균형 대향 튜브. 4 ° C에서 50 분 동안 106,000 XG에 초 원심 분리기. </li&gt; <li> 흡인 (그림 2A)에 의해 그라디언트의 상위 세 번째에 오렌지 핑크 밴드 위의 솔루션의 대부분을 제거합니다. 커에 컷오프 P1000 팁과 오렌지 핑크 밴드를 수집합니다. 표백제 (생물학적 폐기물)를 사용하여 중화 한 후 나머지를 폐기하십시오. </li><li> 얼음처럼 차가운 세척 한 용액의 5 볼륨 - ~ 4로 희석. 필요한만큼 30 ml의 튜브로 분리합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 3,000 XG에 원심 분리기. 조심스럽게 상층 액을 버린다. </li><li> 위에서 설명한 바와 같이 10ml에 재현 탁 펠렛 10 분 동안 3,000 XG에이 솔루션 스핀을 씻으십시오. (15) 용액에 재현 탁 펠렛 3 씻고 10 분 동안 3,000 XG에 다시 스핀. 워시 2 원심 분리하기 전에 필요한 튜브의 수를 줄이고 3 솔루션을 세척하기 위해 여러 펠릿에서 현탁액을 결합합니다. </li></ol></li><li> POS는 표시하지 않고, 분취 : <ol><li> 20 ml의 DMEM - 10에 재현 탁 POS. 예비 희석 (10) 490 μL DMEM (1시 50분)에 μL와에 휙 POS뿐만 아니라 신장 카운트세포 계수 챔버 (도 2B). 1 mL 당 POS 입자의 수​​율과 농도를 계산한다. 참고 : - 8 × 10 9 POS에서 80 돼지 눈 수율은 예를 들어 연령 및 변형 돼지 / 소와 눈의 크기에 주로 따라 달라집니다, 좋은 준비는 5 범위. </li><li> 최종 부피 DMEM 결정 (전형적 10-20 ml) 및 2.5 % 수 크로스의 최종 농도를 수득 크로즈를 추가한다. </li><li> 예를 들어, 원하는 크기의 분량을 준비 / 웰 40 μL에서 96 웰 실험 2 ML의 재 부상 볼륨에 대한 튜브 당 5 × 10 7 POS. RT에서 2,300 XG에서 5 분 동안 1 나누어지는 스핀과 펠릿 크기를 평가한다. POS 두 번 냉동 및 해동하지 말아 서로 다른 응용 프로그램의 볼륨에 대한 다양한 나누어지는 크기를 준비합니다. </li><li> 더 사용할 때까지 -80 ° C에서 POS 씩 동결. 참고 : 분취 량 몇 달 동안 안정하다. 우리의 손에, 레이블 또는 레이블 POS는 1 년 이상 저장할 수 있습니다. </li></ol></li><li> POS 라벨 및 분취 : 참고 : 우리는 일반적으로 식균 작용 분석의 정량화를위한​​ POS 라벨을 FITC를 사용하지만, 다른 염료를 사용뿐만 아니라 필요에 따라 할 수있다. <ol><li> 1.4 ml의 0.1 M 나 2 CO 3의 pH 11.5 (표 2, 재고 솔루션)와 2.6 ml의 0.1 M의 NaHCO3 pH가 8.4를 혼합하여 0.1 M 나 탄산 완충액 pH 9.5에서 2.5 ㎎ / ㎖ 농도로 재현 탁 (1) 10 mg을 FITC 유리 병. 비 재현 탁 FITC 고체 펠릿 최대 속도로 5 분 동안 빛과 스핀에서 보호하면서 실온에서 1 시간 동안 회전합니다. </li><li> 워시 3 솔루션 (또는 DMEM) 10ml에 POS 펠렛을 재현 탁 80 눈 FITC 용액 2 ㎖를 추가합니다. -80 ° C에서 냉동 남은 FITC 저장합니다. 실온에서 적어도 1.5 시간 동안 회전합니다. 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호합니다. </li><li> 2.3.4 절에 설명 된대로 거의 무료 FITC가 뜨는 F에서 볼되지 않을 때까지 한 번 또는 두 번 DMEM에 두 번 씻으 3 솔루션을 사용하여 표시 POS를 씻으raction. DMEM에 재현 탁 POS 및 계산하고, 분취 (2.4 절)에 대한 레이블이없는 POS 용으로 진행합니다. </li></ol></li><li> 실험에 POS를 사용 : <ol><li> 해동 RT에서 POS, 그들이 형광 표지 된 경우 최대한 어두운에 보관. RT에서 2,300 XG에서 5 분 동안 스핀. 뜨는을 기음. </li><li> 실험에 의해 지시 된 바와 같이 즉시 분석 용액의 적절한 용적에 재현 탁. POS 도전 달라지는 경우, 저장소는 수 시간 동안 시간 어두운 점 사이에서 RT에서 POS 재현 탁. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

세 단계 또는 조건이 최적화 된 정제에 매우 중요하다 : 그라데이션 주조 섬세한 그라데이션 튜브 조작의 품질, 냉장 및 수집 단계까지 어둠 속에서 조직을 유지, 망막 균질의 흔들림의 강도는 PR의 나머지 부분에서 적절한 POS 격리을 얻었다 세포. 몇 가지 문제가 제대로 오렌지 대역을 보는 발생할 경우, 인해 상기 세 가지 이유 중 하나 (도 결과 섹션의 두 번째 단락 참조) 가장 가능성...

망막, 시력은 뇌의 시각 영역까지 뉴런 사이에서 전송 될 수있는 신호로 변환되기 전에, 감광성 opsins 불리는 분자의 이성화에 의해 트리거된다. 이들 분자는 시각 세포의 외부 세그먼트 부 PRS ()를 구성 팬케이크 닮은 멤브레인 디스크 스택에 포함된다. 빛과 산화 스트레스 때문에 상당한 수준으로 일정하게 노출 실시한, 푸에르토 리코 놈들은 지속적으로 잠재적 인 산화 적 손상을 제한하기 위해 자신의 외부 세그먼트를 갱신. 감광체 외부 세그먼트는 인접하는 망막 색소 상피 (RPE) 세포의 미세 융모 꼭대기에 밀착된다. RPE 세포는 혈액 망막 장벽의 외측 부분을 구성하며, 이러한 멜라닌 색소, 광 반응성 옵신 성분 망막 재 이성화 제공 영양분 g 통해 광선 담금질 감광체 건강과 기능 1에 중요한 수많은 작업을 보장홍보 대사 처리에 참여하는 요인을 rowth. 또한, RPE 세포는 POS를 보냈다 및 구성 요소, 포유류 망막 2,3의 일주기 리듬에 의해 조절된다 매일 직업을 재활용 제거합니다. 창고 POS의 간격은 PR 생존에 절대적으로 필요하다. 이 완전히 폐기 될 때, POS 파편 축적 PRs를 급속 시력 손실을 야기 4,5- 퇴화. 리듬 프로필이 손실 일정한 활동으로 대체하는 경우, PR 및 RPE 결함은 6 세에 축적된다. 따라서, 해당 장애에 링크 표현형을 이해하기 위해서는 시험관 내에서 RPE 탐식의 분자 특성을 조절하는 것이 매우 중요하다. 흥미롭게도, 망막 색소 상피 세포에서 분자 기계는 세포 사멸을 취소 식세포에서 사용하는 것과 매우 유사하며, 모두 식세포 파편 7-9에 노출 된 포스파티딜 세린의 인식에 따라 달라집니다. 그러나 망막 색소 상피 세포와 대 식세포는 산도를 조절대 식세포는 만남시 사멸 세포의 즉각적인 제거에 대한 선택으로 agocytosis는 다르게, 망막 색소 상피 세포는 리듬 외부 세그먼트 영구 접촉에도 불구하고 하루에 한 번만 POS를 침몰한다. 이것은 아직 완전히 이해되지 않는 특정 규제 메커니즘을 제안한다. 망막 색소 상피 식세포 기계에 연루 분자의 대부분은 확인 또는 격리 된 POS 및 세포 배양 식세포 작용 분석의 사용 덕분에 확인되었다. 리간드 MFG-E8와 협응 혀끝 RPE 세포 표면에 위치 alphavbeta5 인테그린 수용체는 다음 MerTK 티로신 키나제 수용체를 통해 내부화되는 13-15 POS 10-12에 특이 적으로 결합. 소제 CD36 수용체 POS 섭취에 참여하고 그 속도 (16, 17)에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, POS면 (18)에서 산화 인지질의 센서로서 기능 할 수 있습니다. 국제화는 F-액틴 세포 골격 엉덩이의 채용이 필요이러한 넥신 2 (19), 미오신 II (20)과 미오신 VIIA 21, 22로 ociated 단백질. 체외에서 기본 또는 산화 POS도 제대로 소화 산화 POS 23-28의 축적에 연결된 생체 내에서 망막 색소 상피 세포의 노화 표현형을 이해하기 위해 사용된다. 줄기 세포 유래의 RPE 세포의 생성은 동물이나 환자 29,30,27 이식 전에 세포 기능을 증명하기 위해 사용되는 절연 POS 용의 애플리케이션을 개시하고있다. 먼저 1987 31 Molday와 동료에 의해 ​​기술, 소 POS의 분리를위한 프로토콜 (11- 시스 망막을 운반) 표백 망막 photopigment의 특성 오렌지 모양의 관찰 연속 자당 그라디언트에 망막 균질의 초 원심 분리 단계를 결합합니다. 지난 10 년에 광우병의 위험을 최소화하기 위해 취해진 조치에 의한은 돼지의 사용은 눈 increasi되었다ngly 눈에 띄는. 여기에 설명 된 프로토콜은 돼지 또는 분주 장시간 동안 저장 될 수 소의 눈에서 POS 다량 획득하는 방법을 보여준다. 이 POS 준비 및 분석 32,33,21,22 당 동물의 다수 사용해야 쥐 눈에서 POS를 준비 할 필요를 없애 준다. 또한, 형광 분자를 사용하여 저장하기 전에 POS 라벨에 대한 자세한 내용은 정량화 식균 작용 분석 32, 10 후 라벨 POS에 비해 일부 응용 프로그램에 대한 간단하고 비슷한 방식으로 POS를 시각화하기 위해 제공됩니다. 따라서,이 물량은 큰 실험의 다양한 종류의 재현성 및 사용의 용이성을 허용한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="811">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:311px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:108px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:291px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Specific Material/Equipment</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">2-chamber gradient maker</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>gradient maker with 30-ml chambers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">3-mm diameter silicone tubing</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>tubing for gradient casting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">small size magnetic stir bar</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>stir bar fitting the gradient maker chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">red safelight lamp</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>inactinic lamp for dissection in the dark</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Clear 25x89 cm tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344058</td>
			<td>ultracentrifugation tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PP Oak Ridge tubes</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td>30-mL centrifugation tubes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima LE-80K&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>365668</td>
			<td>ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 32Ti swing rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>369694</td>
			<td>swing rotor for ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Avanti J-26 XP</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>393124</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JA-25.50 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>363058</td>
			<td>rotor for Avanti J-26 XP centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">FITC Isomer I</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>F-1906</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Other Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">counting chamber (such as Neubauer or Malassez)</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dark ice buckets with lids</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">scales</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">magnetic stirrer and upholding pole</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">refrigated microcentrifuge</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">37 &#176;C water bath</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">-80 &#176;C freezer</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">labcoat</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Health and safety</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gloves</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sleeve protectors</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">googles</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">absorbent pads</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">biohazard trash bags and bins</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Weck-Prep blades (60-mm/2.25-in wide razor blades)</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-cm plastic dish</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sterile gauze sheets</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15- and 50-mL tubes</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Common consumables</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microtubes</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">aluminum foil</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale purification of porcine or bovine photoreceptor outer segments for phagocytosis assays on retinal pigment epithelial cells

망막 색소 상피 (RPE) 세포, 감광체 외측 세그먼트 (POS)의 소비 세 말단 단편의 탐식 중요한 기능 중 하나의 분석은 시험 관내에서 수행 될 수있다. phototransduction 기계를 포함하는 멤브레인 디스크의 스택과 함께 광 수용체 외부 세그먼트는 지속적으로 망막에 갱신됩니다. 소비 POS는 망막 색소 상피 세포에 의해 매일 제거된다. 설치류, 돼지 / 소 및 인간 RPE 세포는 유사한 방식으로 다양한 종으로부터 POS 인식. 작은 변동으로 큰 시리즈의 실험을 수행하는 것을 용이하게하기 위해, POS의 큰 눈 스톡은 돼지로부터 분리 및 분취 냉동 저장 될 수있다. 이 프로토콜은 어두운 곳에서 보관시 오렌지색 표시 photopigments의 특성을 이용한다. 희미한 붉은 빛에서 절반으로 잘라 열 eyecups에서 버퍼에 망막 수집됩니다. 망막 세포 현탁액을 균질화 연속 수크로오스 구배 상으로 여과시키고로드된다. CEN 후trifugation는 POS는 오렌지 색상 특성을 갖는 그래디언트의 상단부에 개별 대역에 위치한다. POS는 다음 수집, 회전, 세척 버퍼에 순차적으로 재현 탁, 카운트 분주합니다. 이 방법으로 얻어진 POS 식세포 작용 분석 및 POS 도전 후 다양한 시점에서의 단백질 활성 지역화 또는 상호 작용의 분석에 이용 될 수있다. 또한, POS는 전자. 형광 물질로 표시 할 수 g., FITC, 이후의 형광 결합 POS의 정량 또는 말림을 위해, 분취 전에. 다른 가능한 애플리케이션은 산화 스트레스 또는 RPE 세포에 대한 노화의 효과를 연구하기 위해 스트레스 조건과 결합 된 변성 또는 POS POS 도전 사용을 포함한다.

선형 자당 구배 초 원심 분리의 조합은 망막 밀도 현탁액의 다른 구성 요소의 분리를 허용한다. 크고 무거운 망막 및 RPE 세포 파편은 구배 (도 2a)의 바닥 또는 근처에 가라. 망막 라이터 POS 라이터 개별 세포 또는 세포 파편은 원심 분리 기간의 종료에 의해 그라데이션의 상단 절반에 도달하는 등의 별도의 대역을 이동한다. 원심 분리 단계 이후까지 어두운 눈과 샘플을 유지함으로써, ...

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Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 &#176;C.

망막 색소 상피 세포에 탐식 분석 실험에 대한 돼지 또는 소 광 수용체 외부 세그먼트의 대규모 정화

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K 조회수.  INSERM, U968. This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 °C.

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Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

마우스의 응용은 M 세포에 의해 박테리아 이해를 평가하는 Peyer의 패치 장 루프 분석 출혈도 잡았

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

높은 수익률 정화<em&gt; 변형체 falciparum의</emOpsonizing 항체 분석 실험에 사용하기 위해&gt; Merozoites

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

격리, 식별 및 쥐과 흉선 상피 세포의 정화

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

대 식세포 콜레스테롤 고갈과의 식균 작용에 미치는 영향<em&gt; 크립토 콕 쿠스 네오 포르</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles (MPs) are one such type of vesicles, ranging in diameter from 0.1 &#956;m to 1 &#956;m, and typically shed from the plasma membrane of eukaryotic cells undergoing activation or apoptosis. Here we describe the generation of T lymphocyte&#8211;derived microparticles (LMPs) from apoptotic CEM T cells stimulated with actinomycin D. LMPs are isolated through a multistep differential centrifugation process and characterized using flow cytometry. This protocol also presents an in situ cell death detection method for demonstrating the proapoptotic effect of LMPs on bronchial epithelial cells derived from mouse primary respiratory bronchial tissue explants. Methods described herein provide a reproducible procedure for isolating abundant quantities of LMPs from apoptotic lymphocytes in vitro. LMPs derived in this manner can be used to evaluate the characteristics of various disease models, and for pharmacology and toxicology testing. Given that the airway epithelium offers a protective physical and functional barrier between the external environment and underlying tissue, use of bronchial tissue explants rather than immortalized epithelial cell lines provides an effective model for investigations requiring airway tract tissue.

Cell membrane&#8211;shed microparticles (MPs) are active biological vesicles that can be isolated and their pathophysiological effects investigated in various models. Here we describe a method for generating MPs derived from T lymphocytes (LMPs) and for demonstrating their proapoptotic effect on airway epithelial cells.

기도 상피 세포에 림프 미세 입자 및 아폽토시스 효과의 검출 세대

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

레지오넬라 뉴모 필라 외부 막 소포 : 분리 및 대 식세포에 그들의 프로 - 염증 가능성 분석

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and inflammatory intractable diseases. We herein developed an experimental method to investigate phagocytosis quantitatively using the fruit fly Drosophila, in which the gene network controlling engulfment reactions is evolutionally conserved from mammals. In order to accurately detect and count engulfing and un-engulfing phagocytes using whole animals, Drosophila embryos were homogenized to obtain dispersed cells including phagocytes and apoptotic cells. The use of dispersed embryonic cells enables us to measure in vivo phagocytosis levels as if we performed an in vitro phagocytosis assay in which it is possible to observe all phagocytes and apoptotic cells in whole embryos and precisely quantify the level of phagocytosis. We confirmed that this method reproduces those of previous studies that identified the genes required for the phagocytosis of apoptotic cells. This method allows the engulfment of dead cells to be analyzed, and when combined with the powerful genetics of Drosophila, will reveal the complex phagocytic reactions comprised of the migration, recognition, engulfment, and degradation of apoptotic cells by phagocytes.

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

We herein describe a phagocytosis assay using the dispersed embryonic cells of Drosophila. It enables us to easily and precisely quantify in vivo phagocytosis levels, and to identify new molecules required for the phagocytosis of apoptotic cells.

에있는 Apoptotic 세포를위한 Phagocytosis 검정<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to restore function of glands damaged by radiation therapies or due to pathologies associated with Sj&#246;gren's syndrome. A second goal of researchers is to define the mechanisms by which viruses replicate within glandular tissue where they can then gain access to salivary fluids important for horizontal transmission. These goals highlight the need for a robust and accessible in vitro salivary gland model that can be utilized by researchers interested in the above mentioned as well as related research areas. Here we discuss a simple protocol to isolate epithelial cells from human salivary glands and propagate them in vitro. Our protocol can be further optimized to meet the needs of individual studies. Briefly, salivary tissue is mechanically and enzymatically separated to isolate single cells or small clusters of cells. Selection for epithelial cells occurs by plating onto a basement membrane matrix in the presence of media optimized to promote epithelial cell growth. These resulting cultures can be maintained as three-dimensional clusters, termed "salispheres", or grown as a monolayer on treated plastic tissue culture dishes. This protocol results in the outgrowth of a heterogenous population of mainly epithelial cells that can be propagated for 5-8 passages (15-20 population doublings) before undergoing cellular senescence.

We present a method for isolating and cultivating primary human salivary gland-derived epithelial cells. These cells exhibit gene expression patterns consistent with them being of salivary epithelial origin and can be grown as salispheres on basement membrane matrices derived from Engelbreth-Holm-Swarm tumor cells or as monolayers on treated culture dishes.

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...