We would like to thank all members of &#8216;Function of Neuronal Microcircuits&#8217; Group at Institute of Neuroscience and Medicine, INM-2, Research Centre J&#252;lich and the &#8216;Function of Cortical Microcircuits&#8217; Group in the Dept. of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical School, JARA, RWTH Aachen University for fruitful discussions. This work was supported by the DFG research group on Barrel Cortex Function (BaCoFun).

모든 실험 절차는 동물의 보호, 독일의 동물 복지법에 대한 EU 지침 (Tierschutzgesetz)과 유럽 실험 동물 학회의 연맹의 지침에 따라 수행되고있다. 전기 생리학 1. 셋업 한 쌍의 기록으로 시작하기 전에, 전기 생리학 설정 내장되어야한다. 이러한 셋업은 아래와 같습니다 조립 방법에 대한 간략한 개요 : <ol><li> 현미경, 매니퓰레이터와 모든 다른 장비가 배치 될되는 방진 테이블을 설치한다. 주 : 진동 운동의 임의의 다른 종류의 문제는 (기록 전극으로 대체 검색 전극) 피펫의 변경을 요구하기 때문에 시냅스 연결에 기록 할 때 가능한 한 작게 할 필요가있다. </li><li> 전기적 잡음을 감소시키는 방진 테이블 주위에 패러데이 케이지를 놓는다. 패러데이 캘리포니아 내에서 모든 장비를 연결합니다전기 접지와 GE. </li><li> 제조자의 지침에 따라 방진 테이블 전동식 XY 테이블에 기초 동력 축과 초점 현미경을 설치한다. 이것은 신뢰성 좋게 신피질에 연결 전이 층의 경우와 같은 시야에없는 뉴런 현미경을 이동할 수있다. </li><li> 현미경 카메라 포트에 비디오 카메라를 설치하고 슬라이스 준비 및 전극의 움직임을 관찰 및 / 또는 디지털 - 아날로그 화면을 연결한다. 시냅스 결합 된 신경 세포 쌍의 각각 저와 개요를 얻을 수있는 높은 전력 배율 확대 이미지를 전환 할 수있는 카메라를 사용합니다. 이것은 또한 패치 전극의 움직임을 제어하는​​ 것을 돕는다. </li><li> 목욕 챔버에 대한 인세를 포함하는 표본 테이블을 설치 뇌 슬라이스 준비 (방풍 블록에서 사내 드릴). 이 표본 테이블에 연결되지 않아야현미경, 즉, 에어 테이블에 고정되어야하며 현미경은 그 아래의 기동성이 있어야한다. </li><li> 마운트 두 개 (또는 필요한 경우 그 이상)의 모든 입체적으로 이동 될 수 고정밀 미세 조작기. 조작기에 패치 클램프 프리 앰프를 설치하고 메인 앰프에 연결합니다. 주 : 필요한 추가 조작기는, 예를 들어 두 개 이상의 프리 앰프, 세포 외 자극 전극, 약물 전달 시스템 등을 설치할 수 있다면 </li><li> 시편 테이블에서 목욕 챔버를 놓습니다. 솔루션 입구를 설치하고 콘센트와 관류 시스템에 연결합니다. </li><li> / 분 최적의 슬라이스에 대해 6 ml의 생존 - (4)의 안정적인 유속 (표 1 ACSF) 인공 뇌척수액과 기록 챔버의 관류를 유지하는 연동 펌프를 사용한다. 참고 :이 ASCF에서 난류 및 슬라이스 따라서 운동 발생합니다 상당히으로이 유량을 초과하지 마십시오. </리&gt; <li> 시편 테이블 위에 온도 프로브와의 Ag / AgCl을 접지 전극 용 홀더를 설치합니다. 이는 챔버 내의 욕을 샘플링 프로브와 전극을 허용 할 필요가있다. </li><li> 슬라이스 준비 뉴런의 좋은 시야 현미경에 적외선 조명을 사용합니다. 이 때문에 빛의 회절 및 이미지 흐림 현상을 줄일 수 있습니다. 현미경이 &#39;3D&#39; 같은 시각화를 달성하기 위해 미분 간섭 대비 광학 장착되어 있는지 확인합니다. 이 신경 세포 패치 도움 슬라이스 (60 μm의 또는 깊이)에 깊이 신경 세포를 대상으로 수 있습니다. </li><li> 실험 기간 동안, 바닥에 유리 커버 슬립과 실험 실에서 뇌 조각을 유지합니다. 부동에서 슬라이스를 방지하기 위해 슬라이스의 상단에 &#39;백금 하프&#39;를 놓습니다. 백금 하프는에 붙어 치실의 문자열을 U 자형, 평평 백금 와이어에서 이루어집니다. </li><li> OPT를 보장하기 위해 35 °의 C - (32)의 온도에서 슬라이스를 관류 ACSF 유지산소와 pH를 imal 제어 할 수 있습니다. 이것은 욕 챔버로 유입 ACSF 가깝게 설치 펠티에 장치와 용액을 가열하여 수행 할 수있다. 주 : 사용 초박형 커버 높은 개구 짧은 작동 거리 심지어 현미경 응축기 시험편에 집중 될 수 있도록 슬립. 이는 슬라이스의 최적의 조명을 위해 필요하다. 이미지와 뇌 슬라이스 준비 쌍 녹음에 최적화 된 전기 생리학 설정에 대한 설명은 참조. (34) 그림 4 참조. </li></ol> 2. 뇌 슬라이스 준비 <ol><li> 온화 뇌 조직은 이소 플루 란 (최종 농도 &lt;0.1 ​​%)로 촬영되어야하는 동물을 마취. 주의 : 다른 마취제가 또한 사용될 수있다. 마취의 사용은 각각의 동물위원회의 권고 사항과 규정을 준수해야한다. 항상 동물이 추가 한 후에 염증이나 스트레스가 아닌지 확인마취. </li><li> 상기 동물의 목을 벨 두개골을 열고 참고 문헌에 기재된 절차. (34, 35)을 사용하여 가능한 한 빨리 뇌를 제거한다. </li><li> 95 % O 2 5 % CO 2와 carbogen 가스의 혼합물로 폭기 냉각 (4 ° C에서) 인공 뇌척수액으로 뇌를 전송합니다. </li><li> 공부해야하는 뇌 영역을 분리합니다. 참고 : 매개 변수가 최적의 보존과 수상 돌기 및 사전 및 시냅스 후 뉴런의 축색 돌기의 최소한의 절단을 얻기 조사에서 각 신경 세포의 연결 및 발달 단계에 대해 사전에 결정되어야한다. 최적 해부 뇌 슬라이스에서 시냅스 전 신경 세포의 축삭은 슬라이스 표면 평행 할 필요는 없다. 오히려, 그들은 얕은 각도로 조각으로 표시해야한다. 이 시냅스 피라미드 뉴런의 수상 돌기 꼭대기에 적용; 이는 빛을 현미경으로 확인해야합니다. 로컬이 아닌 또는 t 특히 중요하다ranslaminar 시냅스 연결, 즉., 사전 및 시냅스 세포체 200 개 이상의 μm의 떨어져와 수지상 축삭 잘림 확률이 로컬 연결에 대한보다 상당히 높을 수 것입니다. </li><li> 마이크로톰 챔버로 뇌를 전송합니다. 실험 결과에 따라, 다른 세포 외 슬라이스 솔루션은 동물의 나이에 따라 사용되는 (; 도움이되는 정보도 &#39;에서 찾을 수 있습니다 표 2, 3 참조 <a href="http://www.brainslicemethods.com/" target="_blank">http://www.brainslicemethods.com/</a> &#39;참조). </li><li> 대상 영역이 보일 때까지 뇌 트림. </li><li> 동물이 성숙 경우 (3 주&gt;) 400 μm의 두께 뇌 조각 - 좋은 세포 가시성 조각을 얻으려면 300를 잘라. 실질적으로 손상 세포 visib없이 800 μm의 - 동물 (1 ~ 2 성 차 생쥐와 쥐 출생 주) 조각 미숙 한 경우 ~ 600의 두께로 잘라 될 수 있습니다ility. 주 :이 미성숙 슬라이스의 안정성 향상 및 장거리 축삭 돌기 담보 가능 잘림의 수를 감소시킬 것이다. </li><li> 95 % O 2 및 5 % CO 2의 혼합물을 통기 슬라이싱 용액으로 채워져 배양실로 마이크로톰 슬라이스 챔버로부터 전송. 실험의 종류에 따라, 또는 RT ~ 30 ° C에서 어느 적어도 30 분에서 1 시간 동안 배양 챔버에서 슬라이스를 보관. </li></ol> 3. 페어 패치 클램프 녹음 및 Biocytin 필링 시냅스 연결 유형에 따라 서로 다른 세 가지 접근법은 시냅스 결합 뉴런을 찾기 위해 사용된다. (대부분의 흥분성 연결 예상 될 수있는) 접속 확률이 낮을 경우 다음과 같이 진행 : <ol><li> 낮은 연결을 통해 신경 세포의 연결 <ol><li> 나열된 조성물의 내부 용액으로 패치 피펫 채우기표 4에서 전체 셀 구성에있는 모든 기록은 3 사이의 농도 biocytin 추가 -. 사전 및 시냅스 후 뉴런에 대한 좋은 염색 결과를 얻기 위해 내부 (피펫) 솔루션 5mg / ml가. (신경 세포의 크기에 따라) 30 분 - 적어도 15 세포 내로 확산 biocytin하자. 참고 : 아래에 언급 된 &#39;검색&#39;피펫에 사용되는 용액에 biocytin 추가하지 마십시오. </li><li> 전체 세포 모드 추정 시냅스 후 뉴런 패치. 가늘고 긴 생크와 패치 피펫을 사용합니다. 이것은 대물하에 피펫의 기동성을 용이하게하고 전극 슬라이스에 도입 될 때 발생할 수있는 움직임 아티팩트를 감소시킨다. </li><li> 10 MΩ 저항과 작은 팁 직경 - 그럼, (8)의 &#39;검색&#39;패치 피펫을 사용하여 세포 부착 구성에서 잠재적 인 시냅스 전 뉴런 패치. 이 피펫으로 &#39;느슨한&#39;세포 부착 된 패치를 설정합니다. FILK + L은 시냅스 세포에 대한 검색 동안 뉴런 탈분극하지 않도록 나 + (표 5)에 의해 교체되는 내부 용액과 &#39;검색&#39;피펫. 참고 : &#39;느슨한&#39;씰 저항이 GΩ 범위에없는 있지만, 일반적으로 약 30-300 MΩ. </li><li> 현재 클램프 모드에서 약 -30 MV -60에 &#39;느슨한&#39;실에서 막 전위를 잡습니다. 잠재적 인 시냅스 세포의 활동 전위를 유도하기 - (2 nA의 0.2) 다음에, 큰 전류 펄스를 적용합니다. 전압 응답에 작은 이삭으로이 활동 전위를 관찰합니다. </li><li> 시냅스 응답의 런 다운을 방지하기 위해 0.1 Hz로 자극 주파수를 설정합니다. 뇌 조직은 매우 미숙 또는 시냅스 연결이 매우 신뢰할 수 없습니다 경우에 낮은 자극 주파수를 사용합니다. </li><li> 경우 &#39;시냅스&#39;뉴런 시험 &#39;시냅스&#39;NEU의 자극에 응답하지론은 &#39;느슨한&#39;씰 모드에서 새로운 신경 세포를 패치. 30 MΩ이 설정&gt;의 저항 씰만큼 &#39;검색&#39;패치 전극을 교체하지 마십시오. 이 방법으로 30 잠재적 시냅스 신경 세포까지 테스트합니다. 주 : 느슨한 패치 클램프 검색 절차 동안 신경 손상을 방지하기 위해, 단지 부드럽게 흡입 전 세포 패치 피펫에 적용된 것과 비교 검색 피펫에 적용되어야한다. </li><li> 대기 시간 EPSP / IPSP의 &#39;느슨한&#39;씰 모드 결과에 자극은 &lt;시냅스 후 뉴런에 5 밀리 초는 시냅스 전 뉴런에서 &#39;검색&#39;피펫을 제거합니다. </li><li> biocytin 함유, 정기적 인 내부 용액으로 충전 패치 전극과 &#39;검색&#39;패치 피펫을 교체합니다. 이 기록 패치 피펫을 확인하는 것은 4의 저항이 - 8 MΩ을; 전극 저항이 될 수있는 낮은 소마 크기가 클수록. </li><li> 시냅스 패치전 세포 전류 - 클램프 모드 뉴런 기록. 시냅스 전 뉴런에서 전류 주입에 의해 활동 전위를 유도하고 시냅스 응답을 기록합니다. 나중에 오프라인 분석을 위해 컴퓨터에 데이터를 저장합니다. </li></ol></li><li> 높은 연결을 통해 신경 세포의 연결 참고 : 높은 연결 비율 (&gt; 30 %)와 신경 세포의 미세 회로를 들어 시냅스 연결을 찾기 위해 다른 절차를 사용합니다. 이 절차는 아래에 설명하고 자주 흥분 연결 (36) 평균보다 높은 연결 비율이 억제 시냅스 연결에 사용됩니다. 연결 비율이이 값 이하로 떨어질 때 사용되어서는 안된다. <ol><li> 전 세포 모드에서 직접 시냅스 신경 패치. 그 후, 잠재적 인 시냅스 신경 패치 또한 전체 셀 모드. 두 세포는 현재 클램프 통제하에 있어야한다. 시냅스 세포에서 활동 전위를 유도. postsy에 대한 미래의 시냅스 후 뉴런을 모니터naptic 가능성. </li><li> 경우 뉴런은 시냅스 전 자극에 반응을 보여 정규 내부 용액으로 충전 패치 전극을 사용하여 전체 세포 모드에서 새로운 뉴런 패치 않는다. 연결이 발견되면, 패치 피펫을 변경하지만 녹화를 진행하지 않는다. 그런 다음, 단계 3.1.9에서와 같이 진행합니다. </li></ol></li><li> 갭 접합을 통해 신경 세포의 연결 참고 : 전기 (갭 접합) 연결을 검색하려면 가능성이 낮은 연결에 사용되는 수정 된 버전입니다 다음 절차를 사용합니다. <ol><li> 전 세포 패치 클램프 구성에서 시냅스 후 뉴런 패치. </li><li> 10 MΩ 저항 - 7의 &#39;검색&#39;패치 피펫을 사용하여 - 그 후, 느슨한 밀봉 구성의 추정 시냅스 전 뉴런 (300 MΩ (30)의 낮은 씰 저항) 패치. 이 피펫은 느슨한 밀봉 자극에 대한 수정 된 높은 나 + 내부 용액으로 충전해야합니다. </li><li> Inject 100-300 밀리 초 &#39;느슨한&#39;씰을 통해 긴 과분극 전류 펄스; 피펫 명령 잠재력은 약 -60 MV -70로 설정해야합니다. &#39;시냅스&#39;신경 세포에있는 작은 과분극 응답이 자극 결과의 경우 간극 결합 연결을 확인하십시오. </li><li> 전체 세포 모드 &#39;연접&#39;뉴런 재 패치 및 전술 한 바와 같이 진행. 참고 : 축삭과 수상 돌기 프로세스의 좋은 염색을 위해 아래의 프로토콜을 사용합니다. 이 프로토콜은 간략하게 설명되어 있지만, 우리 실험실에서 사용 조직 화학적 처리를위한 상세한 프로토콜은 참고 문헌에 제시되어있다. (37). </li></ol></li></ol> 4. 조직 화학 처리 <ol><li> 0.1 M 인산 완충액 4 % 파라 포름 알데히드를 함유하는 바이알로 연결된 뉴런의 시냅스 쌍 뇌 슬라이스 옮기고 24 시간 동안 슬라이스를 흥분시키는. 전자 현미경의 경우, 2.5 %를 사용 glutar 슬라이스를 흥분시키는알데히드 및​​ 1 % 파라 포름 알데히드. </li><li> 다음날 더 정착액을 함유하지 않는 통상의 포스페이트 버퍼로 슬라이스를 옮긴다. 10 8 배 - - 6 인산염 완충 조각을 씻어 15 분 각 초과 정착을 제거합니다. </li><li> 내인성 퍼 옥시 다제 반응을 최소화하기 위해 3 % H 0.1 M 인산 완충액 2 O 2 용액을 20 분 동안 인큐베이션 슬라이스. 강한 거품 형성을 관찰한다. 더 이상 거품이 생성되지 않을 때까지 반응을 계속합니다. 나머지 H 2 O 2를 제거하기 위해 (각 10 분) 8 시간 -이어서, 6 0.1 M 인산 완충액 슬라이스를 헹군다. </li><li> 면역 세포 화학 및 발색 반응 biocytin 채워진 뉴런 가시화 디아 미노 벤지딘 촉매로 스트렙 타비 딘 - 비오틴 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 반응에 기초한다; 이 높은 공간 해상도로 선명한 얼룩을 생산하는 어두운 침전물을 생성합니다. 다음 절차는 발색 반응에 사용되는 &lt;OL&gt; <li> 제조의 프로토콜에 따라, ABC 솔루션을 준비합니다. (에만 광학 현미경 표 6)과 어둠 속에서 약 30 분 동안 솔루션을 유지 150 μL 10 % 트리톤 X100 보충 14.55 ml의 인산 버퍼에 추가합니다. 이 솔루션 O에서 / N 사용하기 전에 조각을 품어. </li><li> RT에서 1 시간 동안 진탕하고 어두운 ABC 용액 슬라이스 부화. 그 후, 냉장고에서 4 ° C에서 조각 O / N를 유지합니다. 다음 날 아침에, 추가 시간 동안 실온에서 조각 품어. </li><li> 그 후, 인산 완충액을 10 분마다 조각을 적어도 네 번 씻어. 그리고, 니켈 - 강화 3-3&#39;-디아 미노 벤지딘 용액 (표 7)을 2 ㎖로 어둠 속에서 30 분 동안 진탕 배양한다. 디아 미노을 처리하고 만 흄 후드를 사용할 때주의해야합니다; 심지어 매우 낮은 농도에서 매우 발암 물질이다. </li><li> 6.5 μL 3 % H 2 O 2를 추가 디아 미노 함유솔루션입니다. 갈색 검은 색 스테인드 신경 세포가 눈에 잘 때까지 광학 현미경 하에서 발색 반응을 모니터링합니다. 그런 다음, 인산염 버퍼에 조각을 여러 번 세척하여 즉시 반응을 중지합니다. </li><li> 접착제, 실란 코팅 Histobond 또는 호화 표준 개체 슬라이드에 묻은 신경 세포와 산 조각. </li><li> 적어도 80 %의 습도 O / N와 습한 챔버에서 슬라이드 유지. 다음 날, 조각은 자연 건조 추가로 10 분 동안 할 수 있습니다. 이들을 탈수하기 위해 - (100 %, 20)의 에탄올 농도가 증가함에 따라 용액에, 이전 슬라이드를 매립하기 전에. 주 : 탈수 과정이 그렇지 수지상 축삭 프로세스 왜곡 37 발생할 가능성이 저하 될 것이다. 대안 매립 절차가 선택되면, 예를 들면, 글리세롤 계 Moviol 하나는, 탈수는 필요하지 않다; 그러나이 때문에 불균일 한 조각의 압축과 왜곡 된 신경 morpholo를받을 수 있으므로GY. </li><li> 마지막으로, 크 실롤에서 10 분 동안 품어 광학 현미경에 대한 소수성 매입 매체에 조각을 포함하고 위에 초박형 된 커버를 배치합니다. 슬라이드는 실온에서 20 분 동안 건조 시키십시오. </li></ol></li></ol> 5. 신경 재건 및 시냅틱 연락 현지화 <ol><li> 60X / 100X 오일 침지 목적과 최적의 공간 해상도에 대한 높은 개구와 냉각기가 장착 된 광학 현미경 biocytin 표지 신경 세포와 슬라이드를 검사합니다. 그 축삭의 종말을 확인하고 돌기 쪽이 명확하게 볼 수 있습니다. </li><li> 추적 시스템을 사용하여 상업적 신경 뉴런 또는 시냅스 신경 결합 쌍을 추적 신경 3D 재구성을 얻는다 (구체적인 재료 / 장비의 도표 참조). 심지어 작은 축삭 돌기 또는 담보를 검출하기 위해 일정 육안 검사에서 수동으로 추적을 수행합니다. 시냅스 결합 뉴런에서 짝을 기록 수동 추적은 여전히​​의 방법입니다선택 예를 들어, 사전 또는 시냅스 후 뉴런 중 하나에 축삭 프로파일의 속성은 실질적인 재건 경험이 필요하기 때문이다. </li><li> 필요한 경우, 축삭 종말 및 / 또는 돌기 쪽의 수를 확인합니다. 척추 또는 척추 아형 축삭 종말이 예 피질 층 또는 영역에 대해 특정 분포 및 밀도를 나타낼 수 있기 때문에, 이는 신경 세포 유형의 특성을 도울 수. </li><li> 시냅스 결합 신경 쌍의 경우, 사용할 수있는 최대 배율로 가까운 appositions의 시냅스 축삭과 수상 돌기 시냅스를 확인합니다. 축삭 팽대를 관찰하고 시냅스 돌기 척추 또는 샤프트는 추정 시냅스 접촉으로 간주 될 수있는 동일한 초점면에 있습니다. 재건이 연락처를 표시합니다. </li><li> 추적 프로그램의 해당 섹션에 세 가지 차원 공간에서 수축 신경 재건을 수정합니다. 참고 : 고정 동안, 조직 화학적 처리탈수 상당한 기계적 변형 및 수축이 발생; 이것은 축삭 및 수상 돌기 길이 측정에 영향을 심하게 그들의 공간 배열을 왜곡한다. 매립 매체 수축 정정 인자는 Z 방향 (37) ~ x 및 y 방향에 대한 1.1 ~ 2.1이다. </li><li> 정량적 형태소 분석 (특정 재료 / 장비의 표 참조)에 대한 신경 생리 데이터 분석 프로그램을 사용한다. </li></ol>

The authors declare no conflict of interest.

시냅스 결합 흥분성 및 / 또는 억제 뉴런에서 짝 기록은 신경 세포의 미세 회로의 연구에 매우 다양한 접근 방법이다. 뿐만 아니라, 이러한 접근 방식은 하나의 신경 세포 유형 간 시냅스 연결을 추정 할 수 있도록 할뿐만 아니라 연결 및 사전 및 시냅스 후 뉴런의 형태의 기능적 특성을 결정 허용 않는다. 또한, 작용제 및 / 또는 길항제 쉽게 슬라이스 제제 뉴런에 적용될 수있다. 이것은 하나의 예?...

두 개의 뉴런 사이의 시냅스 결합 미소 신경은 뇌에서 대규모 네트워크의 구성 블록과 시냅스 정보 처리의 기본 단위이다. 이러한 신경 미세 회로의 특성을위한 전제 조건은 형태학 및 사전 및 시냅스 후 뉴런 파트너 모두의 기능적 특성, 시냅스 연결 (들) 및 그 구조 및 기능적 메커니즘의 유형을 아는 것이다. 그러나 시냅스 연결의 많은 연구에 저항기의 뉴런의 적어도 하나의 특징이 잘되지 않는다. 이것은 종종 시냅스 연결의 연구에 사용 비교적 비특이적 자극 프로토콜의 결과. 따라서 시냅스 전 뉴런의 구조적 및 기능적 특성은 모두 하나 또는 단지 약간 작은 정도로 식별되지 않은 (즉, 마커 단백질의 발현 등). 마커들에 의해 세포 내 염색과 함께 짝을 녹음biocytin, neurobiotin 또는 형광 염료 UCH는 작은 신경 세포의 미세 회로를 공부에 더 적합하다. 이 기술은 사람이 동시에 형태학 식별 시냅스 연결의 구조적 및 기능적 많은 파라미터를 조사 할 수있다. 두 개의 뉴런 사이의 소위 &#39;단일&#39;monosynaptic 연결은 급성 슬라이스 준비를 사용하여 두 피질 및 피질 뇌 영역 1-10 조사되었다. 먼저, 날카로운 미소 전극은 이들 실험에 사용 하였다; 이상, 패치 클램프 기록은 낮은 잡음 레벨과 시간 해상도 개선과 시냅스 신호들의 기록을 얻기 위해 사용 하였다. 중요한 기술적 진보는 적외선 미분 간섭 대비 (IR-DIC) 광학 11-14, 크게는 수 t이되도록 뇌 조각에서 뉴런의 가시성과 인식을 개선 현미경 기술을 사용했다O를 시각적으로 확인 된 시냅스 연결 15-17에서 녹음을 구하십시오. 일반적으로 짝을 녹음 급성 슬라이스 준비에서 수행된다 매우 소수의 출판물은 생체 18-20에서 시냅스 연결 뉴런에서 사용할보고 기록이다. 페어링 레코딩의 가장 중요한 장점은, 기능적 특성은 광학 및 전자 현미경 수준 모두에서 형태 학적 분석과 결합 될 수 있다는 사실이다 (참조 예., 7,16,21). 조직 화학적 처리 후 시냅스 신경 접속 쌍의 축삭 돌기 형태가 추적된다. 이어서, 이들 변수는 다음 특정 시냅스 연결의 대물 분류 기준을 제공 할 수있다 등의 길이, 공간적 밀도, 방향 분지 패턴 형태 적 특징을 정량화 할 수있다. 또한, 접속 .. 신경 연구를위한 다른 기술이 사용되는 대부분 대조적vity, 쌍 기록은 단일 시냅스 연결을위한 연접의 식별을 허용합니다. 이는 광학 및 전자 현미경 16,21-27의 조합을 이용하거나 돌기 쪽의 칼슘을 사용하여 28, 29 촬상 직접 행해질 수있다. 그러나, 후자의 접근 방식 만 아니라 흥분 억제 성 연결이 연구 될 수 그것이 시냅스 후 수용체 채널을 통해 칼슘 유입을 필요로. 정의 신경 저항기 쌍의 녹화에서 시냅스 전달의 상세한 분석 외에도 시냅스 규칙 (30, 31)의 조사를 허용 또는 - 아세틸 콜린 (32) 및 아데노신과 같은 신경 전달 물질에 의해 시냅스 전달의 조절 - 작용제 / 길항제 애플리케이션과 함께 (33).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Name</td>
			<td style="width:199px;">Company</td>
			<td style="width:199px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:199px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Amplifier</td>
			<td style="width:199px;">HEKA</td>
			<td style="width:199px;">EPC 10 USB Triple</td>
			<td style="width:199px;">with 2-3 preamplifiers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:199px;">Microscope</td>
			<td style="width:199px;">Olympus</td>
			<td style="width:199px;">BX51WI</td>
			<td style="width:199px;">with 2 camera ports and a 4&#215; objective, a 40&#215; water-immersion objective</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Camera</td>
			<td style="width:199px;">TILL Photonics</td>
			<td style="width:199px;">VX55</td>
			<td style="width:199px;">infrared CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:199px;">Workstation</td>
			<td style="width:199px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:199px;">Infrapatch 240</td>
			<td style="width:199px;">with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:199px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:199px;">SM-5</td>
			<td style="width:199px;">x-y-z manipulators for 2-3 preamplifiers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Faraday cage</td>
			<td style="width:199px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Anti-vibration table</td>
			<td style="width:199px;">Newport Spectra-Physics</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Patchmaster</td>
			<td style="width:199px;">HEKA</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Microtome</td>
			<td style="width:199px;">Microm International</td>
			<td style="width:199px;">HM650V</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:199px;">HEKA</td>
			<td style="width:199px;">Sutter P-97</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Neurolucida system</td>
			<td style="width:199px;">Microbrightfield</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:199px;">with Neurolucida and Neuroexplorer softwares</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings

동시에 세포 내 biocytin 충전 급성 뇌 조각 준비에 두 개 (또는 그 이상)의 시냅스 결합 뉴런 (쌍 녹음)에서 패치 클램프 녹음의 조합은 구조적 및 기능적 특성의 상관 분석을 할 수 있습니다. 이 방법으로 그들의 형태 및 전기 생리 학적 반응 패턴에 의해 모두 사전 및 시냅스 후 뉴런을 식별하고 특성화 할 수있다. 쌍으로 녹음이 뉴런 사이의 연결 패턴뿐만 아니라 모두 화학 및 전기 시냅스 전송의 특성을 연구 할 수 있습니다. 여기서, 우리는 신경 세포 형태의 최적의 복구와 함께 안정적인 페어링 녹화를 얻기 위해 필요한 절차를 단계별로 설명을 제공한다. 우리는 화학적 시냅스 또는 갭 접합을 통해 연결된 뉴런의 쌍 뇌 슬라이스 준비에서 확인하는 방법을 설명합니다. 우리는 뉴런 dendrit 그들의 3 차원 형태를 얻기 위해 재구성 방법을 간략하게 설명 할 것이다IC와 축삭 도메인과 방법 연접 식별 및 지역화됩니다. 우리는 또한 특히 뇌 조각의 준비 기간 동안 수지상 축삭 잘림과 관련된 사람들은이 강하게 연결 추정 영향을 미치므로, 한 쌍의 기록 기술의주의 사항 및 제한 사항에 대해 설명합니다. 그러나, 한 쌍의 기록 방법의 다양성으로는 뇌에서 확인 된 신경 세포의 미세 회로에서 시냅스 전달의 다양한 측면을 특성화에 유용한 도구로 유지됩니다.

짝 기록은 형태 학적으로 확인 된 대학 또는 양방향 시냅스 연결에 대한 심도있는 특성에 대한 선택의 방법뿐만 아니라 간극 결합 (전기) 연결 (그림 1)입니다. 체성 감각 피질 배럴의 층 (4)에 한 쌍의 기록의 예는도 1a에 도시된다. 단방향 흥분성과 억제 성 시냅스 연결 둘 다 (그림 1B, C)을 특징으로 할 수있다. 또한 짝을 녹음 한 쌍의 두 신경 사전 및 서로 연?...

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Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

급성 뇌 조각에서 신경 세포의 미세 회로의 전기 생리 및 형태 학적 특성은 페어 패치 클램프 녹음을 사용하여

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

electrophysiological-morphological-characterization-neuronal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.1K 조회수.  Research Centre Jülich. Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

비디오: Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

연구

신경과학

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

모터 신경 세포의 이점 패치 클램프 레코딩과 Zebrafish의 대상 골격근

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" />
Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

NRCC 패치 - 클램프 칩에 대한 세포의 Culturing 및 전기 생리학

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA 2 +</sup망막 조각의 단일 신경 터미널에서> 영상

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

귀에 세포의 패치 클램프 녹음 절연 Zebrafish에서

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

배아 Zebrafish의 MAUTHNER 세포에서 패치 클램프 녹음

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

컴퓨터를 이용한 다중 전극 패치 클램프 시스템

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

해마의 Organotypic 조각의 쌍으로 전체 셀 녹음

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...