이 통신 이전 바이러스학 저널 BioMed 중앙로 크리에이 티브 커먼즈 저작자 표시 라이센스 (<a href="http://creativecommons.org/licenses/by/2.0">http://creativecommons.org/licenses/by/2.0</a>)의 조건에 따라 오픈 액세스 모드에서17 에 게시 하는 결과에 따라 한 정식 사용자입니다. 저자 기꺼이 인정 조종 연구의 프레임 워크에서 열매가 많이 열리는 협력 "약물 및 만성 전염병" ("DRUCK 연구") 미국 마커 스, W. Cai, W. 장와 R. 짐머에서는 로버트 코흐 연구소 (베를린, 독일)과 그림 1 뿐만 D. F. Whybrew, 박사 (괴팅겐, 독일)로 해결 하기 위한 조립 사진 복용에 대 한 S. Moyrer에 게 감사 하는 원고. 또한 제이 Ackermann, E. Bayrambasi, 미국 Büttner, S. Dziubek, I. Jakobsche, B. Krellenberg, H. Krohn, P. Kusimski, A. Metcalf, J. Piejek, S. 자아 르에 숙련 된 기술 지원에 대 한 그들의 감사를 표현 하는 그들은 M. Schröter와 K.이. 이 연구는 부분적으로 지원 국가 참조 센터 건강의 독일 교육부의 교부 금에 의해 간염 c

프로토콜은 의료 진단에 사용 하기 위해 설계 되었습니다, 이후 응용 프로그램 헬싱키 선언19의 원칙을 준수 해야 합니다. 이 통신에 제시 하는 결과의 첫 번째 부분에 대 한 두 환자에 의해 별도 계약 및 윤리 위원회에 의해 승인 될 듯 불가결 두 가지 이유: (1) "입학" 에센 대학 병원, "모든 환자 제공 시 서 면된 동의 모든 필요한 생화학, 세균, 및 virological 조사. " 17 (2) "DBS 테스트의 평가에서 사용 되는 모든 샘플에 보내진 일상적인 임상 진단 과정에서 바이러스학 연구소. 따라서, 아무도 표본 연구 목적을 위해 특별히 수집, 하지 단일 추가 venipuncture 수행 및 자료의 정상적인 과정에서 의사에 의해 요구 된 모든 매개 변수에 대 한 테스트를 했다 진단 작업 업입니다. " 17 연구 "약물 및 만성 전염병" (DRUCK 연구 ")18, 있는 DBS 테스트 마지막으로 사용 되었다 베를린, 에센의 독일 도시에서 적극적으로 약물을 주사 하는 사람을 평가 하는 데이터에 대 한 연방 위원에 의해 승인 되었다 보호 및 자유 정보 (베를린, 독일)의 고도 의료 대학 Charité (베를린, 독일)의 윤리 위원회로.
1입니다. 혈액의 수집
<ol><li>Venipuncture14, 15, 20, 21<ol>
<li>일회용 라텍스 고무 장갑에 넣고 적절 한 살 균 제, 예를 들어, 70% 이소프로필 알코올 의도 펑크 사이트 (선호 메디아 cubital 정 맥 antecubital 포에서)의 영역을 청소.</li>
		<li>적용 한 지 혈 대 정 맥 distend를 putative 펑크 사이트 위에 4-6 인치. 환자의 정 맥에 바늘을 안내 하 고, 일단 자리에, 부드럽게 연결 된 혈액 튜브, EDTA 항 응고 제로 포함 된 채우기.</li>
		<li>최대한 빨리 venipuncture 완료 되는 지 혈 대 놓고 바늘을 철회. 그런 다음, 이후에 열릴 수 있다 장소에서 붕대에 의해 찔린 사이트에 마른 거 즈 패드를 누릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>피부 빵 꾸 (그림 1A)13-15, 20, 22, 23,<ol>
<li>일회용 라텍스 고무 장갑 한 켤레를 입었다.</li>
		<li>피부 빵 꾸, 전에 환자 자신의 손을 따뜻하게 해야. 손가락 마사지 anterogradely 리치 사이트 펑크 쪽으로 혈액 흐름 이다.</li>
		<li>적합 한 살 균 제, 예를 들어, 70% 이소프로필 알코올 비 쓰기 손의 세 번째 또는 네 번째 손가락의 팁 원심 phalanx의 손바닥 쪽의 피부를 청소. 단일 사용 안전 란 셋에 의해 피부를 찔린 합니다. 중력은 손가락에 혈액의 수집을 용이 하 게 같은 위치에 손가락을 개최 한다.</li>
		<li>피부 펑크에 의해 모 세관 혈액의 수집 완료 되 면 손가락 끝에 붕대를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 준비의 핏 자국
<ol><li>Venipuncture15 에 의해 수집 된 혈액에서 준비<ol>
<li>필터 카드에 수집 된 안티 응고 (EDTA) 전체 정 맥 피를 최대한 빨리 자리. Venipuncture 후 24 시간 이상 말린된 핏 자국을 준비 하지 마십시오.</li>
		<li>필터 카드에 환자의 식별에 필요한 모든 정보를 넣어. 한 개인의 혈액 만으로 하나의 카드를 발견 한다.</li>
		<li>일회용 라텍스 고무 장갑에 넣어.</li>
		<li>부드럽게 반전 혈액 컬렉션 튜브 2-4 시간 하 고 이후 신중 하 게 마 개를 엽니다.</li>
		<li>일회용 팁을 피 펫을 사용 하 여 전체 정 맥 혈의 50 µ l 발음 필터 종이 피 펫의 끝을 직접 건드리지 않고 한 원의 중심에 혈액을 전송. 완전히 포화 원 하려고 합니다.</li>
		<li>카드의 모든 필요한 서클을 채우기 위해이 절차를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>피부에 의해 수집 된 혈액에서 준비 펑크 (그림 1B 및 1 C)13-16, 23<ol>
<li>거 즈 패드와 함께 혈액의 첫 번째 드롭 다운을 닦아 초과 조직 체액을 포함할 수 있기 때문에. 펑크 사이트에서 혈액 흐름을 증가를 다시 손가락을 마사지. 손가락으로 직접 화면을 건드리지 않고 다음 드롭 필터 카드의 서클 중 하나에 전송. 혈액 모 세관 힘만에 의해 필터의 질감에 배어 있을 수 있습니다.</li>
		<li>손가락 끝에서 모 세관 혈액 형성의 다음 큰 드롭 시키고 원에 수집. 모든 필요한 동그라미 가득 또는 혈 중지 될 때까지이 절차를 계속 합니다.</li>
		<li>쥐 어 짜기 하지 또는 "우유" 손가락 지나치게 혈액 흐름 필터 카드의 모든 필요한 서클을 채우기 위해 충분 하지 않은 경우. 혈 중지 손가락 끝에는 붕대를 놓습니다. 더 많은 혈액 검사를 위해 필요한 경우에 다른 손가락 두 번째 피부 빵 꾸를 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 혈액 명소의 건조
<ol><li>핏 자국 건조, 넣어 깨끗 한 종이에 카드 생물 안전 캐비닛에 수건 고 말리, 필터 선호 O/N (하지만 적어도 4 시간), 열의 어떤 외부 소스의 부재에 실시간에. 건조 과정 완료 되, 혈액의 관광 명소는 균일 하 게 어두운 갈색 색상 고 없는 빨간색 영역을 볼 수 있습니다 더 이상 (그림 1D)13, 15, 16.</li>
</ol>4. 저장 및 건조 혈액 명소 (DBS)의 교통
참고: 혈액 명소의 처리 건조 후 중단 될 수 있습니다. 필터 카드 이제 저장된13-16, 23수 있습니다.
<ol><li>스토리지, 필터 종이 카드는 표본 습기 로부터 보호 하기 (그림 1E) 1 ~ 2 desiccant sachets을 포함 하는 단일, 가스 불 침투성 지퍼 가방에 넣어. 습도 지시자 카드는 필요에 따라 추가 합니다.</li>
	<li>-20 ° C의 온도 냉동 실에이 가방을 전송 또는 가능한 한 빨리 낮은. 냉동 고를 필드 조건에서 사용할 수 없는 경우, 최대 14 일 동안-4 ° C에서 또는 심지어 주위 온도에 저장은 가능 합니다.</li>
	<li>드라이 아이스에 냉동된 DBS 표본 전송. 필터 카드 처음 온도에서 보관, 지퍼 되었는데 내부 컨테이너 뿐만 아니라 내부 및 외부 봉투의 구성 된 트리플 패키징 시스템을 사용 합니다. 아니 콘텐츠 표시 일반 우편 배송에 대 한 외부 봉투에 필요 하지만 국제 생물 학적 기호16기본 내부 컨테이너 부착 해야 합니다.</li>
	<li>건조제 팩 및 추가 습도 지시자 카드는 핑크 색상을 변경 하는 경우 추가 처리에서 필터 카드를 제외 합니다.</li>
</ol>5. 건조 혈액의 차입 명소13, 15, 16, 23
<ol><li>단일 사용 6 m m 장치 학년 903 필터 카드 (그림 1 층)의 혈액 젖 ㄴ 원 각에서 한 자리 펀치. 한 환자에서 12-잘 접시의 한 잘 모두 천공된 말린된 핏 자국을 전송.</li>
	<li>0.05% 트윈 20와 0.08% 나트륨 아 지 드 (그림 1G)을 포함 하는 인산 염 버퍼 염 분에 잘 채워. 말린된 피 반점 있다의 후속 분석을 위해 사용 하는 분석 결과의 최소한의 각 요구 사항에 추가 된 버퍼의 볼륨을 적응.</li>
	<li>분자 분석을 수행 하기 위해 자리 있다 건조 혈액의 두 번째 시리즈를 얻기 위해이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>셀 문화 접시 실험실 셰이 커에 넣고 부드럽게 4 시간 최소 elute 천공된 말린된 혈액 명소 하 게 또는, 선호, O/N (그림 1 H).</li>
	<li>다음 날, 관광 명소는 혈액에서 거의 자유롭다 고 hemolytic supernatants (그림 1I) 형성. Microcentrifuge 튜브 전송이 있다. 그런 다음, 차입 (그림 1 K) 동안에 형성 했다 어떤 파편 든 지에서 supernatants를 10500 x g (그림 1J)에서 2 분 동안 원심 분리를 그들을 주제.</li>
</ol>6입니다. 있다 분석
<ol><li>Centrifuged 있다 의도 분석에 사용할 수 지금 있습니다. B 형 간염 바이러스, C 형 간염 바이러스 및 상용 키트를 사용 하 여 HIV 감염의 표시를 위한 있다 조사 하 고 해당 제조 업체의 지침을 따르십시오 (그림 1 L).</li>
</ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52619/52619fig1.jpg"> 그림 1. 준비 및 건조 혈액 명소 immunoassays 분자 기법에 의해 사용 될에이 통신에 제안 된 프로토콜의 그래픽 요약. 전체 정 맥 혈과 모 세관 혈액 바소 (A)에 의해 venipuncture 또는 피부의 펑크에 의해 얻은 말린된 혈액 자리 분석 표본으로 봉사 할지도 모른다. 학년 903 필터 카드 (B, C)의 서클에는 혈액의 양도, 후 샘플 해야 건조 선호 O/N 생물 안전 캐비닛 빨간색의 어떤 interspersion 없이 균등 하 게 갈색 색상의 양식 명소에 주위 온도에 (D) 지역입니다. 건조 혈액 명소 완료 되 고 저장이 필요한 필터 카드 포장 될 수 있다 1-2 desiccant sachets (E)을 포함 하는 가스 불 침투성 지퍼 가방에. 통 (H에 최소 4 시간 또는, 선호, O/N의 PBS 기반 버퍼에 펀치의 차입 (F, G), 원의 중심에서 6 mm 단일 사용 장치에서 펀치의 세대를 구성 하는 DBS의 실험실 처리 ), 있다 (나), 그리고 마지막으로 실험실 컵 (J) (K) 과정에서 차입 유래 수 어떤 파편 든 지에서 DBS 있다 무료의 원심 분리의 복구. 그 후, DBS 있다 각각 HBV, HCV, HIV 감염의 혈 청 학적인 마커를 탐지 하기 위해 완전 자동화 된 플랫폼 (L)에 의해 수행 되었다 분석에 대 한 준비가. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

과거에는, RSR 애 보트 진단에서 강 및 그의 과학적인 일에 대 한 재정 지원을 제공 하는 사례금을 받았다. NG와 옴 들은 전혀 상반 되는 관심사를 선언 합니다.

DBS 100 년2 에 대 한 사용 되었습니다 하지만, 놀랍게도, 아직 그들의 준비 및 처리에 대 한 일반적인 합의 없다입니다. 날짜 하려면,이 중요 한 사전 분석 단계의 충분 한 표준화만 달성 하고있다 신생아 검사14의 분야에서 다양 한 다른 프로토콜 DBS 테스트5, 16, 23의 다른 모든 응용 프로그램에 대 한 존재 하는 반면. 이 놀라운이 극복 하기 위해 immunoassays과 분자 기술로 활용 될 준비 하 고 DBS를 처리에 대 한 포괄적인 단계별로 지침이이 통신에 및 그 효과 관한 평가 HBV, HCV, HIV 감염의 마커를 감지에 대 한 합니다. 다음 논의의 초점은 주로 제안 된 프로토콜의 여러 단계에 배치 됩니다.
많은 다른 지를 테스트 하는 DBS의 역사에서 카드 사용된2 왔지만 오늘만 두 상용 소스 장치로 클래스 II 의료 혈액 컬렉션5, 16에 대 한 FDA에 의해 승인 됩니다. 이러한 필터 카드 시스템 매우 균일 하 고 그들 중에 준비 하는 모 세관 혈액에서 얻은 분석 결과 4%-528이상으로 차이가 없습니다 있도록 매우 유사한 흡수 특성을가지고. 아니나 다를까, Masciotra와 동료29 따라서 hiv-1 RNA를 발견 다른 소스에서 혈액 컬렉션 카드에서 차입 후 질적 분석 결과와 동등 하 게 잘. 이러한 데이터를 감안할 때, 그것은 제외할 수 있습니다 거의 테스트 때 관찰 하는 불일치의 HBV, HCV의 표식에 대 한 혈 청/DBS 쌍을 결합 하 고 HIV 감염17 혼자 필터 카드의 선택에 의해 발생 했다. 그러나, 정확한 정량화 된 분석의 불가결 이면 소스-소스 변형 더 이상 무시할 수 없습니다 및 더 정교한 기술, 예를 들어, microsampling30 또는 준비 하기 위한 방법으로 DBS (PDB) 천공 건조 혈 청 관광 명소의 (DSS)31 기존의 DBS10테스트 대신 적용할 할 수 있습니다.
DBS 테스트에 사용 되는 작은 양의 피 때문 (모 세관 혈액 한 방울 이루어져 약 50 µ l)5, 16, 샘플 볼륨 변화는 중요 한, 그리고 명백 하 게, 적어도 일부의 혈 청 학적인 결과 사이의 불일치 그리고 참가자의 자기 보고 "DRUCK 연구"의 조종 하는 동안 기록 하는 HBV 및 HCV 상태가 변수에 기인. 샘플 볼륨의 "변동"을 최소화 하기 위한 하나의 가장 중요 한 요인은 의심할 여 지 없이 기술 인력22의 신중 하 고 지속적인 훈련에 의해 달성 될 수 있는 모 세관 혈액 컬렉션의 올바른 기술입니다. 또한, 품질 관리의 수단으로 모든 실험실 작업 DBS는 이미 시작 합니다 식별 하 고 그 후 불만족 또는 유효 하지 않은16으로 간주 될 수 있는 DBS 표본 제외에 대 한 절차.
주로 HIV32 의 맥락에서 연구 하 고 신생아 심사33 높은 습도, analytes의 저하로 이어질 수 있습니다 하지만 지금까지 아무런 합의 도달 했습니다 얼마나 DBS air-dried 해야한다의 질문에 대 한 . O/N이이 통신에서 HBV와 HCV에 사용할 이후에 모든 관련 간행물32, 34 데이터 DBS의 저장에의 대다수에서 사용 된 조건을 따라서 채택 제안 간격 4 시간 이상 또는 선호 테스트 상반 된다입니다. 1981 년, 빌라와 동료35, 현대 분석 기법을 적용, 보고는 RT에 스토리지 미치지 않았다 HBV 분석의 결과 180 일의 전체 관찰 기간 동안 항 체 titers 라면 > 1/1000, 하지만 그 DBS 15 일 titers 혈 청에만 1/100 후 경계선 긍정 또는 부정적인 되었다. -20 ° C 또는 4 ° C에서 저장 상당한 개선에 발생 하지 않았다. 대조적으로, 30 년 이상36 테스트 HBV 양성 샘플의 복제를 연구 하 고 저자 발견 그 Anti-hbc 뿐만 아니라 안티-HBs 항 체 했다 최대 183 일 동안에 RT, 안정적인 반면 동일한 조건 하에서 HBsAg 되었다 63 일 후에 이미 false 음수가 DBS 있다에서 HBV DNA 검출, 관련 바이러스 핵 산의 농도 37 ° C37 에 적어도 7 일 동안 안정 또는 최대 3 주까지 RT에서 저장소에 "저항" 입증38. 117 일 DBS 샘플-20 ° C, 2-8 ° C, 및 20-25 ° C에 각각 저장을 사용 하 여 기간에 대 한 정확한 결과 제공 하는 immunoassays39 두 상용 제 3 세대를 사용 하 여 안티-HCV 항 체 테스트. 하지만-20 ° C에서 저장, 광학 밀도의 낮은 변화 귀착되는. 적용 하는 4 세대 안티-HCV ELISA, 즉, Monolisa HCV-Ag-Ab-울트라, DBS 테스트, Larrat 그 외 여러분 의 맥락에서 40 데시벨 표본 실시간에 3 일 이상 저장 후 분석 특이성에 날카로운 감소를 관찰 다른 한편으로, 정확한 테스트 결과 같은 키트 샘플 Brandao 및 동료41에 의해 다양 한 조건 (-20 ° C, 2-8 ° C, 및 22-26 ° C)에서 60 일 동안 입금을 이용 하 여 얻은 했다. 다양 한 보관 조건에서 DBS에서 HCV RNA 농도의 감소에 대 한 관찰 최대 1 년42 RT에서 없음 중요 한 변경에서 온도434 주 후 10 배로 변경 범위. DBS 표본 사용할 수의 저장소에 대 한 이전 정의 합의를 제안 된 프로토콜에서 철회 합리적인 듯 HBV 및 HCV 항, 핵 산 및 계정에 항 체의 안정성에이 오히려 충돌 데이터를 복용, HIV 검사15, 30: 단기 증 착 (최대 2 주)에 대 한 항 원, 바이러스 성 핵 산 및 항 체 간주 됩니다 RT에서 안정으로 오랜 동안 보관 냉동된 조건에는.
일반적으로 세 개의 매개 변수가 고려 되어야 할 때 차입 프로토콜 설계: (1) 차입 버퍼; (2) 기간 및 차입;의 온도 (3) 차입 볼륨23. 모든 관련 간행물의 대다수에서 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) DBS, 방출 사용 되었다 고 대부분 저자 추가 단백질, 예를 들면, 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 또는 트윈 20, 계면 활성 제, 안정화 하 여 분석 결과 신호를 개선 단백질, 그들은 솔루션을 동시에 차단 비 특정 바인딩 사이트23로 서. DBS 테스트의 컨텍스트에서 다른 차입 버퍼, 직접 비교는 단지 몇 가지 보고서를 사용할 수 있습니다. 빌라 외. 36, 예를 들어, 기록 된 모든 버퍼 PBS/BSA 하지만 사용에 대 한 거의 차입 용량 0.5% 비 특정 반응성의 저급에 결과. 매우 비슷한 관찰 Croom 및 동료44 에 의해 만들어진 DBS에서 안티-HCV 항 체의 차입에 대 한 유전학 시스템 rLAV EIA의 표본 희석제를 적용할 때. 관광 명소 주위 온도에 O/N을 품 어 부드러운 끝 이상 혼합 하 여 차입 과정을 지원 하 고 샘플 저하의 위험 DBS (위 참조)의 준비 후 첫 번째 시간에서 매우 낮은 이기 때문에, 결정 되었다. 이 방법은 표본 이전 날 렸을 장점이 하루 옮겨질 수 있다 직접 일상 진단 일찍 다음 아침23. 차입 버퍼의 희석 비율을 가능한 한 낮게 유지 후속 분석을 위해 사용 하는 분석 실험의 최소한의 각 요구 사항에 적응 한다. 그러나 높은 견본 처리량 "DRUCK 연구"17동안 비교적 짧은 시간에 보장 해야 하기 때문에, 모든 단일 분석에 대 한 차입 조건의 주의 최적화 이전 평가에서 가능 하지 않았다. 따라서, 오히려 불리 한 볼륨 PBS 기반 버퍼의 1000 µ l의 두 가지 별도 작업의 모든 매개 변수에 대 한 전체 차입 과정을 완료 하기 위해 사용 되었다.
하나이 이렇게 한 손으로 "완전히 낮은 항 체 농도; 인해 HIV에 감염 하는 그 개인에 대 한 안티-HBc/안티-HBs 시스템에서 실패 ..., 그것은 분자 생물학 절차 HBV DNA에 관해서는 최적의 분석 감도 및 필요 HCV RNA 검사. " 17 다른 한편으로, 높은 차입 볼륨 어떠한 방식으로 HBsAg, 안티-HCV, 및 평가에서 사용 되는 키트에 의해 반대로 HIV에 대 한 불리 한 것으로 판명. "전체 혈액 있다에서 긍정적인 재료 100 µ l, 250 µ l, 또는 600 µ l, 500 µ l의 훨씬 작은 차입 볼륨 사용 부분에서 이전 연구에서 유사 하 게 높은 정도로 98.6%의 감도와 성공 HBsAg의 검출"17 36, 45, 46. 안티-HCV 항 체는 이미 존재의 결과에 대응에 대 한 179 혈 청/DBS 쌍의 조사에서 결정 하는 97.8%의 민감도 보고서24, 44, 47, 48, 49, 5 ~ 10 배 낮은 차입 볼륨 근무 했다. "또한, 안티-HCV 검출에 대 한 프로토콜 했다 적절 하 게 최적화 되었습니다... 자신의 잘라 포인트를 규정 하 여"17, 24, 48, 49 "또는 20 µ l에서 100 µ l의 샘플 볼륨을 증가." 17, 49 마지막으로, 분석 특이성 및 감도 (100%) 반대로 HIV 탐지에 대 한 설립 했다 같거나 다른 immunoassays DBS 테스트50, 51 에 특히 적응의 성능 특성에 우수한 "나는 단계적 몇 가지 항 HIV 테스트의 결합된 사용과 절차"17,52. "그들은, 실제로, 또한 초과 했다 특별히 개발 되었으며 DBS 있다 (Q 방지 HIV 1 + 2 DBS 키트)에서 항 HIV 항 체의 검출에 대 한 최적화 된 분석 결과의 성능 기록." 17, 53  
함께 찍은,이 통신에 포괄적인 단계별 프로토콜 가능 하 고 사용자 친화적인 도구를 준비 하 고 처리 하는 DBS 입증 하 고 따라서 진단 바이러스학에 안정적으로 사용할 수 있습니다. 그것은 자동화 54 를 사용 하 여 접근을 허용 한다 고 우수한 성능 특성으로 인해 종류 DBS 실험실에서 테스트의 글로벌 분야에서 미래의 일반적으로 허용된 합의 프로토콜에 대 한 초석의 역할을 의학입니다.

셀 루 로스로 만든 종이 카드에 수집 된 혈액을 사용 하는 아이디어는이 기독교 방 (1869-1918 년), 현대 임상 microanalysis1, 2의아버지 관찰 작용. 1913 년에 쾅 있다 건조 혈액 명소 (DBS)3 의 하 고, 나중에, 또한 질소 측정 킬달 메서드를 사용 하 여이 필터 종이 기술2에서 포도 당 결정. 그 후, 여러 조사를 매 독2진단 혈 청 학적인 테스트 위한 DBS의 사용에 보고. 마찬가지로 일찍 1924 년에서 채 프 먼 DBS 테스트의 장점을 요약 때 그가 특히 강조는 여전히 유효한 오늘 4 개 항목: (1) 기존에 비해 venipuncture, 적은 혈액 볼륨 필수 이며이 사실을 소아에서 가장 중요 한 진단; (2) 혈은 간단, 비 침략 적, 하 고 저렴 한; (3) 세균 오염 또는 용 혈이 최소한의; 그리고 (4) DBS analytes2, 4의 거의 아무 저하와 오랜 기간 동안 보존 될 수 있습니다. 매 독에 대 한 테스트에 사용, 게다가 DBS 기술의 더 이른 응용 프로그램, 예를 들면, 홍 역, 유행 성 이하선염, 소아마비, 파라 인플루엔자 바이러스, 그리고 호흡 syncytial 바이러스 (RSV)에 대 한 항 체의 검출에에서 포함 19532, 배설물에서 이질균의 식별 필터 종이에 건조와 DBS 발병 지역에서 촬영 하 고 3 개월 후 분석5에서에서 Schistosoma에 항 체의 검출으로 서 네덜란드 라이덴 인도네시아에서 일반 우편으로 배송 . 1963 년, 50 년 후 빵의 원래 통신2, 6, 오클라호마 마침내 출판 신생아7, 8에서발뒤꿈치 미친 놈 여 DBS에서 페닐케톤뇨증의 진단에 대 한 그의 유명한 방법.
그 시간 이후부터 DBS는 수집에 대 한 일반적으로 적용 가능한 방법으로 간주 되었다, 저장, 수송, 및 다양 한 인간의 체액5, 분석 진단에 그들의 사용 아직도 남아의 진단에 주로 초점을 맞춘 리소스 제한 설정 및 수십 년9, 10에 대 한 상속 된 대사 장애에 대 한 신생아의 체계적인 검사에 특히 감염. 그러나 2005 년부터,, 새로운 혁신적인 DBS 응용 프로그램의 다양 한 등장 하기 시작 했다. 이 결과 현재에서 매년 거의 450 약 50에서 DBS에 각각 과학적인 간행물의 수에 거의 기 하 급수적 증가. 신흥 응용 프로그램 toxico-그리고 pharmacokinetic 연구, 대사 프로 파일링, 치료 약물 모니터링, 법의학 독성, 또는 환경 오염 제어10, 11등 다양 한 분야 이다.
DBS 테스트, 따라서, 했다 임상 실험실 진단을 통해 개선 3 월 동안 과거 100 년2. 그러나 임상 화학12에서,이 3 월 중 사전 분석 변수 하지 적절 하 게 고려 되었다 몇 년 동안. 사실, 심지어 오늘날, CDC의 필터 종이 평가 프로젝트13 또는14, 사전 분석 단계를 차단 하는 신생아의 프레임 워크에서 필터 종이에 혈액 컬렉션에 대 한 국가 표준의 정립 등 저명한 활동 후 여전히 크게 과소 평가는 DBS 테스트는 적용5, 10, 다른 분야의 대부분 에입니다.
이 배경을 감안할 때, 포괄적인 단계별 프로토콜14-16 에서 사용 immunoassays 분자 기술에 커버의 모든 필수 단계, 준비 하 고 다음과 같은 통신에서 DBS를 처리에 대 한 제안: (1) 컬렉션의 혈액; (핏 자국;의 준비 2) (3) 건조 혈액 명소; (4) 저장과 수송; (DBS;의 차입 5) 그리고 마지막으로 (6) 분석의 DBS 있다. 프로토콜의 효과 처음 평가 1762 결합 된 혈 청/DBS 쌍 B 형 간염 바이러스 (HBV) 표면 항 원 (HBsAg), HBV 코어 항 원 (Anti-hbc), HBV 표면 항 원 (HBs 안티), HBV DNA에 항 체에 항 체 검출을 위한 항 체 C 형 간염 바이러스 (HCV) (안티-HCV)에 HCV RNA, 및 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 1-p24-항 원/항-HIV 1/2는 완전 자동화 된 플랫폼 또는 민감한 질적 핵 산을 사용 하 여 테스트 합니다. 17. 두 번째 단계에서 프로토콜 파일럿 연구 "약물 및 만성 전염병" ("DRUCK 연구") 활성에 의해 로버트 코흐-연구소의 긴밀 한 협력에 국가 참조 센터 C 형 간염에 대 한 실시 되었다에서 이용 되었다 베를린, 에센18의 독일 도시에서 마약 사용자.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Latex rubber gloves</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#4049500041515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropyl alcohol</td>
			<td>Bode Chemie</td>
			<td>#9768050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mulifly safety cannula</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#85.1638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA blood collection tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#02.1066.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive bandage</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#2994163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry gauze pad</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>#143213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Singel-use safety lancet</td>
			<td>Owen Mumford</td>
			<td>#3802421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Card</td>
			<td>Whatman/sigmaaldrich</td>
			<td>#10534612</td>
			<td>Filter paper card Grade 903</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pipette tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>#S1126-7810, #S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipper bag</td>
			<td>Flexico</td>
			<td>#20219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini desiccant bag</td>
			<td>Tropack</td>
			<td>#-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Punch</td>
			<td>pfmmedical</td>
			<td>#48601</td>
			<td>6.0 mm Disposable Biopsy Punch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Forceps</td>
			<td>Servoprax</td>
			<td>#H7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>#665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>#A1389.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#66880250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT HBsAg (Qunatitative)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#6C3642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HBc II</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#8L4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HBs</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#7C1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT anti-HCV</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#6C3725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>#4J2727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#6374891001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>artus HBV LC PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#4506063 (24 tests), #4506065 (96 tests)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT HCV TMA Assay IVD</td>
			<td>Siemens Healthcare</td>
			<td>#2554311</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dried blood spots - preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques

종이 카드에 혈액을 수집 하 고 이후에 전 세기를 유래 하는 진단 목적을 위해 건조 혈액 명소 (DBS)를 사용 하 여 아이디어. 그 이후, DBS 테스트 주로 남아 있다 십 년간에 대 한 리소스 제한 설정에서 특히 전염 성 질환의 진단에 초점을 또는 상속 된 대사 장애에 대 한 신생아의 심사 체계적이 고 유일한 최근 다양 한 새롭고 혁신적인 DBS 응용 프로그램을 시작 합니다. 많은 년에 대 한 사전 분석 변수만 부적절 하 게 여겨졌다 DBS 테스트의 오늘 조차, 신생아 검사, 준비 구성 전체 사전 분석 단계 및 처리를 위한 DBS를 제외한 분야에서 그들의 최종 분석 하지 표준화 되었습니다. 이 배경을 감안할 때, 커버 알 필수 단계, 포괄적인 단계별 프로토콜 제안, 즉, 컬렉션의 혈액; 핏 자국;의 준비 핏 자국;의 건조 저장과 수송의 DBS; DBS, 그리고 마지막으로 DBS 있다의 분석의 차입. 이 프로토콜의 효율성 먼저 B 형 간염 바이러스, C 형 간염 바이러스, 및 자동화 된 분석 플랫폼에 인간 면역 결핍 바이러스 감염의 마커 검출을 위한 1762 결합 된 혈 청/DBS 쌍으로 평가 되었습니다. 두 번째 단계에서 프로토콜 파일럿 연구, 베를린, 에센의 독일 도시에서 활성 마약 사용자에 실시 되었다 동안 이용 되었다.

준비를 위해 제안 된 프로토콜의 효과 DBS의 처리 처음 HBV, HCV, HIV 감염의 마커 1762 결합 된 혈 청/DBS 쌍을 분석 하 여 평가 되었다. 17.이 목적을 위해 DBS 100 µ l 전체 정 맥 혈 (cf. 포인트 2.1.1-이전 프로토콜의 2.1.6)에서 준비 했다 및 1000 µ l의 PBS 기반으로 eluted 했다 버퍼, 각각, (참조 포인트 언급 한 프로토콜의 5.1-5.5) 프로세스를 완료 하려면 대 한 두 개의 별도 작업에서 모든 7 개의 매개 변수입니다. 모든 단일 분석에 대 한 차입 조건의 주의 최적화 없이 이러한 접근 방식은 다소 높은 샘플 처리량은 차기 현장 연구 "약물 및 만성 중 비교적 짧은 시간에 예상 때문에 피할 수 없을 듯 전염 성 질병"("DRUCK 연구").
모든 측정 DBS 분석 과정에서 제조업체의 권장 사항을 준수 하지만 HBsAg 및 안티-HBs 결정 중 혈의 효과 또는 희석의 결과 대 한 보상에 관하여 수정 했다. 0.05 IU/ml의 컷오프 값 (그림 2A) 샘플링 HBsAg의 테스트 DBS 있다 리드 14.7% (52 명 중 354)의 거짓 반응의 속도에 비교 될 때 혈 청에. 수신기 작동 특성 (ROC) 분석25, 26 의 데이터 표시 0.15 IU/ml을 임계값의 증가 HBsAg-원판 (0.986 [감도], [1-특이성], 0.000에서에서 HBsAg 양성의 이상적인 분리 될 그림 2B)입니다. 다른 한편으로, 안티-HBs의 정량화에 대 한 10 IU/l의 차단 항 체의 14.2% (47 명 중 331) false 네거티브 측정 율은 기록 (그림 2C). 따라서, ROC 분석 다시, 다음이 컷오프가 낮아졌다 1.5 IU/l 값 (0.917 [감도], 0.007 [1-특이성], 그림 2D)의 최적의 차별 달성 하기.
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52619/52619fig2.jpg"> 그림 2. HBsAg 및 안티-HBs DBS 있다 (에서17수정)에서 테스트. ROC 기반 증가 HBsAg 정량화 0.05 IU/ml에서 (A)을 0.15 IU/ml의 컷오프 값의 (B) 감소 거짓 양성 결과의 비율 14.7%에서 0%로. 마찬가지로, 안티-HBs 농도의 ROC 분석은 해당 임계값 10 IU/l (C)에서 1.5 IU/l (D), false-원판, 처음 모든 결정의 14.2%를 차지 하 고 그로 인하여 완전 하 게 제거의 감소를 제안 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
결합 된 혈 청/DBS 분석의 결과 표 117에 요약 되어 있습니다. 아니 비 특이성 DBS 7 analytes에 대 한 테스트 동안 기록 되었다.
DBS 있다 HBsAg, i. e. HBV, 급성 및 만성 감염의 혈 청 학적인 키 매개 변수의 존재에 대 한 조사 되었다 98.6%의 분석 감도 결정 했다. 2 거짓 부정 세라에 HBsAg 농도 되었고 749 IU/ml 6 IU/ml, 각각. 안티-HBc 항 체 성공적으로 204 중 176 (i. e 86.3%)에서 발견 되었습니다. DBS 있다입니다. 개인 공동 hiv 감염에서 유래 하는 측정에 의해 탐지 되지 했다 28 표본에서 스 물 둘. 따라서, HIV 양성 개인은 계산에서 제외 된, 97.1%의 감도 eluted 말린된 전체 정 맥 혈에서 안티-HBc 항 체를 검색에 대 한 달성 되었다. 유사한 관측 안티-HBs 항 체의 결정에 대 한 진정한 개최. 1.5 IU/l 분석 결과의 컷오프 값의 조정, 후에 9 어긋나는 세럼 DBS 결과 발생 했습니다. 공동 hiv 감염 환자는 너무 낮게 건조 혈액의 차입 후 검색 허용 했다 11-26 IU/l의 혈 청 안티-HBs 농도 발견 했다.
안티-HCV 항 체는 급성 또는 만성 또는 해결 감염을 나타내는 있습니다. DBS 있다에서 4 (i. e. 2.2%) 틀리게 네거티브 안티-HCV 결과 결정 및 serological 및 분자 분석 명확 하 게 입증 각각 세라 그 감염 했다 오래 된 환자에서 찍은 아주 아마 해결.
DBS 있다 완전 자동화 된 시스템에 반대로 HIV 항 체의 검출은 100%의 분석 감도 굴복 완전히 부드러운 과정 이었다.
"전 혈 있다에서 평균 HBV DNA 농도 100 표본에 수행 되었다 (DNA 농도 의미: 1,573,898 IU/ml, 범위: < 357-> 17,860,000 IU/ml) 93.0%의 값을 생성 하 고. 따라서, 낮은 혈 청 HBV DNA 농도 409 3,643 IU/ml 사이 7 샘플 테스트 DB 검색 되지 했다. HCV RNA 긍정적인 것을 입증 했다 100 세라의 (HCV RNA 농도 의미: 1,415,944 IU/ml, 범위: 2,479-> 7,692,000 IU/ml), 해당 전체 혈액 aliquots를 사용할 수 없었습니다. 비교 조사 결과 DBS 있다에서 HCV RNA 결정에 대 한 100%의 분석 감도. " 17
준비 하 고 필드 조건에서 DBS 처리 개요 프로토콜을 테스트 하기 위해 긴밀 한 협력으로는 로버트 코흐 연구소 (베를린, 독일) 연구 "약물 및 만성 전염병"는의 시험 단계 동안에 사용 되었다 베를린, 에센18의 독일 도시에서 활성 마약 사용자에 실시. 섹션 2.2.1-2.2.3 이전 프로토콜의 세부 사항에 설명 된 대로 모든 534 참가자 등록 (433 남녀 101) 모 세관 혈액 샘플링을 받았다 그리고 DBS, 다시, eluted PBS 기반 버퍼의 1000 µ l의 추가 의하여.
두 개인 만성 HBV로 감염 된 것으로 진단 된 39 해결된 HBV 감염의 혈 청 학적인 패턴을 보여주었다. 또한, 15 참가자 안티-HBs (예방 접종 후 상태)에 대 한 긍정적인 이었고 8 Anti-hbc 혼자에 대 한 긍정적인 것을 발견 했다. 참가자 중 안티-HCV 보급은 57.3% (N = 193) 베를린, 73.0% (N = 144) 에센에서. 항 체 양성에서 샘플링 65% (N = 125) 및 62% (N = 89) viremic도 했다. 534 개인에서 25 항 HIV에 대 한 긍정적인 테스트합니다. 감염의 19는 이미 알려져 있었다 고 이러한 개인의 24 공동 HCV 감염 했다.
DBS 테스트 결과 연구 참여자의 상태와 관련 된 자기 보고 HBV 및 HCV 이루게 데이터 신중 하 게 비교 되었다. 테스트의 결과와 함께에서이 비교 혈 청/DBS 쌍 "DRUCK 연구", 6 개의 추가적인 큰 독일 도시에서 활성 마약 사용자를 등록 하는 주요 단계에 대 한 테스트 알고리즘의 작은 수정에 led를 결합: "개인 감염 된 HIV HBV DNA의 존재에 대 한 항상 시험 될 것 이다. 참가자의 DBS 있다는 긍정적인 Anti-hbc 또는 안티-HBs 복종 되어야 한다는 venipuncture에 두 번째 상담 동안 확실히 그들의 안티-HBc/안티-HBs 상태를 명확히 하기 위해, 모든 DBS 있다 HCV RNA에 대 한 검사 하는 것입니다 마지막으로, 안티-HCV 테스트의 결과."에 17
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody>
<tr>
<td>매개 변수</td>
			<td>결합 된 세라/DBS 있다 (N)</td>
			<td>어긋나는 결과 (N)</td>
			<td>혈 청 및 DBS 있다 테스트 사이의 불일치에 대 한 이유</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBsAg</td>
			<td>299</td>
			<td>2</td>
			<td>2 만성 HBV 감염을 가진 환자입니다. 둘 다 항 바이러스 치료 받고 있었고 그들 중 하나 이었다 공동 hiv 감염. 혈 청에 있는 항 원 농도: 749 IU/ml 및 6 IU/ml, 각각.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-hbc</td>
			<td>305</td>
			<td>28</td>
			<td>혈 청, 20-2 환자는 해결된 HBV 감염을 했다. 6 개인 serological 찾는 "안티-HBc 혼자" 보였다. 환자의 20-2 공동 hiv 감염 했다. "HBV 확인자"에서 20으로 평가 했다 "안티-HBs 긍정적인 혼자" DBS 테스트 및, 따라서, 거짓 "예방 접종 후 조건"으로 분류 되었다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>안티-HBs</td>
			<td>310</td>
			<td>9</td>
			<td>4 환자 에이즈 감염 공동 했다 세럼 안티-HBs 농도 11-26 IU/l, 너무 낮은 건조 혈액 명소의 차입 후 항 체 검출에 대 한 수 있도록 했다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBV DNA</td>
			<td>150</td>
			<td>7</td>
			<td>각각 세라 3,643 IU/ml까지 409 IU/ml에서 낮은 혈 청 HBV DNA 농도와 7 명의 환자에서 얻은 되었습니다 했다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HCV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>안티-HCV</td>
			<td>339</td>
			<td>4</td>
			<td>이러한 4 세라 해결된 HCV 감염 이후 긴 환자에서 촬영 됐다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>HCV RNA</td>
			<td>150</td>
			<td>0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>에이즈</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HIV 1-p24/반대로 HIV 1/2</td>
			<td>209</td>
			<td>0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 이 준비 되었고 전체 정 맥 혈 다음이이 통신에 제안 된 프로토콜에서 처리, 1762 DBS에서 얻은 결과 참조로 결합 된 혈 청 샘플의 결과에 비해.

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Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques

준비 하 고 그들의 최종 분석에 대 한 건조 혈액 명소 (DBS)의 처리는 여전히 저조한 대부분 진단 응용 프로그램에 대 한 표준화 됩니다. 이 단점을 극복 하기 위해 포괄적인 단계별 프로토콜은 제안 하 고 이후 바이러스 성 감염의 마커를 탐지 하기 위한 그것의 효과 관한 평가.

말린된 피 명소-준비 및 Immunoassays 및 분자 기술 사용에 대 한 처리

The idea of collecting blood on a paper card and subsequently using the dried blood spots (DBS) for diagnostic purposes originated a century ago. Since ...

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Research

JoVE Journal

Biology

39.4K 조회수.  University of Duisburg-Essen. 준비 하 고 그들의 최종 분석에 대 한 건조 혈액 명소 (DBS)의 처리는 여전히 저조한 대부분 진단 응용 프로그램에 대 한 표준화 됩니다. 이 단점을 극복 하기 위해 포괄적인 단계별 프로토콜은 제안 하 고 이후 바이러스 성 감염의 마커를 탐지 하기 위한 그것의 효과 관한 평가.

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Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

의 유사 분열 유학을위한 Microinjection 기법 Drosophila melanogaster Syncytial 엠브료

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

연구

생물학

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

Microfluidic 프로브 : 운영 및 현지화된 표면 처리에 사용

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently represents a relatively narrow area of research and descriptive data on specific methodology is correspondingly scarce. The anatomical features of guinea pigs are slightly different from other rodent models, hence modulation of sampling techniques to accommodate for species-specific differences, e.g., compared to mice and rats, are necessary to obtain sufficient and high quality samples. As both long and short term in vivo studies often require repeated blood sampling the choice of technique should be well considered in order to reduce stress and discomfort in the animals but also to ensure survival as well as compliance with requirements of sample size and accessibility. Venous blood samples can be obtained at a number of sites in guinea pigs e.g., the saphenous and jugular veins, each technique containing both advantages and disadvantages4,5. Here, we present four different blood sampling techniques for either conscious or anaesthetized guinea pigs. The procedures are all non-terminal procedures provided that sample volumes and number of samples do not exceed guidelines for blood collection in laboratory animals6. All the described methods have been thoroughly tested and applied for repeated in vivo blood sampling in studies within our research facility.

Though a known model, the guinea pig currently represents a niche in experimental animal sciences and limited data is available on the execution of most procedures. Here we present four different approaches to non-terminal in vivo blood sampling techniques in either conscious or anaesthetized guinea pigs.

기니 돼지의 비 터미널 혈액 샘플링 기법

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

정제 된 야생형과 돌연변이 체 CFTR 단백질의 기능의 재구성 및 채널 활동 측정

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

유동 세포 계측법을 사용하여 세포 외 소포의 분석을위한 기술

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from zebrafish has not been established. The previous methods for blood collection from zebrafish are lethal, such as lateral incision, decapitation and tail ablation. Thus we have developed a novel &#8220;repeated&#8221; blood collection method, and present here a detailed protocol outlining this procedure. This method is minimally invasive and results in a very low mortality rate (2.3%) for zebrafish, thus enabling repeated blood sampling from the same individual. The maximum volume of blood sampling is dependent on body weight of the fish. The volume for repeated blood sampling at intervals should be&#160;&#8804;0.4% of body weight every week or &#8804;1% every 2 weeks, which were evaluated by measurements of blood hemoglobin. Additionally, hemoglobin, fasting blood glucose, plasma triacylglycerol (TG) and total cholesterol levels in male and female adult zebrafish were measured. We also applied this method to investigate the dysregulation of glucose metabolism in diet-induced obesity. This blood collection method will allow many applications, including glucose and lipid metabolism and hematological studies, which will increase the use of zebrafish as a human disease model organism.

Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

성인 Zebrafish의에서 혈액 검사에 대한 반복 채혈

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

총회와 &#39;전단 반지&#39;의 응용 프로그램 : 궤도, 단방향 및 정기 유체 흐름 및 전단 응력에 대한 소설 내피 모델

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, implantation of transgenic cells and tiny optical sensors. However, intravenous microinjections into small animals, which are mostly used in biological and veterinary laboratories, are very difficult and require trained personnel. Herein, we demonstrate a robust and efficient method for the introduction of microparticles into the circulatory system of adult zebrafish (Danio rerio) by injection into the fish kidney. To visualize the introduced microparticles in the vasculature, we propose a simple intravital imaging technique in fish gills. In vivo monitoring of the zebrafish blood pH was accomplished using an injected microencapsulated fluorescent probe, SNARF-1, to demonstrate one of the possible applications of the described technique. This article provides a detailed description of the encapsulation of pH-sensitive dye and demonstrates the principles of the quick injection and visualization of the obtained microcapsules for in vivo recording of the fluorescent signal. The proposed method of injection is characterized by a low mortality rate (0-20%) and high efficiency (70-90% success), and it is easy to institute using commonly available equipment. All described procedures can be performed on other small fish species, such as guppies and medaka.

This article demonstrates the principles of a quick, minimally invasive injection of fluorescent microparticles into the circulatory system of small fishes and the in vivo visualization of the microparticles in fish blood.

간단 하 고 효과적인 관리 및 신장 주입을 사용 하 여 작은 물고기의 순환 시스템에 미의 시각화

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

X 선 Microcomputed 단층 촬영에 따라 옥수수 혈관 번들의 미크론 단위 형질 기법

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...