우리는 DNA 마이크로 어레이 슬라이드 생산에 대한 도움말 앤 드 종과 Siger Holsappel 감사합니다. 생물 정보학 분석을위한 앤 드 종의 지원도 받고있다. 우리는 또한 종이를 검토 할 Jelle Slager 감사합니다. 무하마드 아프과 이르판 Manzoor는 HEC 파키스탄의 교수 개발 프로그램에 따라 GC 대학, 파이 살라 바드, 파키스탄에서 지원됩니다.

1. 미디어의 준비 및 세포 배양 <ol><li> S. 성장 앞서 설명한 바와 같이 11 폐렴 D39 야생형 균주 21. 화학적 6.4 (15)의 최종 pH 중형 (CDM)가 정의 50 ㎖ 중의 (50 ㎖에 1/100의 비율 멸균 튜브) 10 % 글리세롤에 C o를 -80 저장된 세포에 접종하지만 아미노산으로부터 L 세린 생략 혼합물. 주 : 두 개의 다른 CDMS 사용 하였다; L 세린 (10 mM)을 최대 농도를 함유하는 세린 L (150 μM) 및 기타의 최소 농도를 함유 한. 이러한 최소 농도는 기본적으로 인간 혈장 세린 L의 농도이며 목적은 S.의 유전자 발현을 비교하는 것이다 이 두 가지 조건에서 폐렴 D39 변형. </li></ol> 총 RNA 2. 분리 <ol><li> 재료 <ol><li> 총 RNA의 분리를 위해 산 페놀, RNA 등급을 사용합니다. </li><li> Macaloid : <ol><li> 의 2g을 일시 중단100 ml의 TE에 macaloid 5 분 동안 끓인다. 50 ml의 TE pH가 8 점에서 4 ° C에서의 RT에서 5 분, 재현 탁 2,000 × g에서 솔루션 macaloid gels.Centrifuge까지 RT와 초음파 처리에 차가운. </li></ol></li><li> 솔루션 : <ol><li> 디 에틸 피로 카보네이트 (DEPC) 모든 솔루션을 취급합니다. 15 분 동안 37 ° C에서 O / N을 배양하고 오토 클레이브, 100 μL의 DEPC / 100 ml의 솔루션을 추가합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 방법론 <ol><li> S. 50 ml의 성장 중간 지수 단계 (OD ~ 0.3)까지 37 O C (아무 흔들림)에 50 ㎖ 튜브에 폐렴 D39 세포 배양. 2 분 동안 10,000 × g에서 4 ° C에서 원심 분리기 문화. 미디어를 취소하고 즉시 액체 질소에서 세포 펠렛을 동결. </li><li> 프레 믹스 300 μL의 클로로포름 : IAA (24 : 1) 300 μL 페놀 (페놀 산, RNA 학년). 단계 2.2.3 유기상 500 μl를 사용한다. </li><li> RNA가없는 스크류 캡 튜브에 사전에 다음과 같은 혼합물을 준비 : 00.5 g 유리 비드 50 ㎕의 10 % SDS, 500 μL의 페놀 / 클로로포름 : IAA (단계 2.2.2에서 제조 한 바와 같이), macaloid 층 (150-175 μL, 매우 점성없는 정확한 같이). 400 ㎕의 TE (DEPC)에있는 세포 펠렛을 재현 탁하고 나사 캡 튜브에 재현 탁 세포를 추가합니다. </li><li> 세포를 파괴하기 위해 얼음에 1 분 간격으로 2 배 60 &quot;펄스에 대한 비드 비터 ( &#39;균질화&#39;)에 나사 캡 튜브를 배치합니다. 원심 분리기 10,000 ×의 g (4 ° C에서)에서 10 분 동안 샘플. </li><li> 신선한 튜브에 상위 단계로 이동 500 μl의 클로로포름 추가 IAA (24 : 1) 원심 분리기 5 분 동안 10,000 ×의 g (4 ° C)에서. </li><li> 용해 / 바인딩 버퍼의 두 볼륨 (1 ml)에 추가, 신선한 튜브 상위 단계의 500 μl를 전송하고로 pipetting 아래로 섞는다. RNA 분리 키트를 사용하여 총 RNA를 분리하고, 제조업체에게 권장 프로토콜을 따릅니다. </li></ol></li></ol> 3. R​​NA 정리 &lt;<html> OL&gt; <li> 총 RNA에서 DNA의 오염을 제거 100 μL DNAseI 믹스 (90 μL의 DNase의 버퍼와 10μl의 DNAseI)를 추가하고 15 ~ 25 ºC에서 20 ~ 30 분 동안 품어합니다. </li><li> 워시의 RNAse 키트를 사용하여 RNA를 청소. 용출 볼륨의 50 μl를 얻습니다. </li></ol> RNA 4. 분석 <ol><li> 분광 광도계에 RNA의 농도를 결정합니다. (도 2)는 다음과 같이 분석을 이용하여 RNA의 품질을 결정한다. <ol><li> 20-200 NG / μL의 농도를 얻을 DEPC 물 50㎕의 샘플을 1 μL 희석. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 Bioanalyser에 품질을 확인하기 위해 1 μL 희석 RNA 샘플을 사용합니다. </li></ol></li><li> 참고 : 23S의 비율 : 약 2.0 16S가 좋은 것으로 간주됩니다 한 A260 단위 RNA가 40 ㎍ / ㎖의에 해당한다.. 라벨에 대한 권장 금액은 10 ~ 20 μg의입니다. </li></ol> 5. cDNA를 준비하고 레테르를 붙이기 ntent &quot;&gt; 참고 : 다음 프로토콜이 cDNA를 제조 및 라벨링에 대한 하였다. <ol><li> 가열 냉각 <ol><li> 만든 슬라이드 또는 회사에서 만든 슬라이드 5㎍을 위해 총 RNA 10 ~ 15 μg의 농도를 유지, 300 ㎕를 PCR 튜브에 어닐링 반응을 수행합니다. 2 μL 임의 nonamers (1.6 ㎍ / μL)와 RNA를 혼합하고 18 μL에 어닐링 혼합물의 최종 부피를 유지하기 위해 필요한 경우 핵산 분해 효소가없는 물을 추가합니다. </li><li> 5 분 동안 70 ℃에서 어닐링 유지 혼합물. 그 후, 10 분 (어닐링)에 대한 RT 혼합물을 냉각하고, 필요한 경우, 관의 바닥에 반응을 스핀 다운. 적어도 1 분 동안 얼음에 반응 튜브를 놓습니다. </li></ol></li><li> 역전사 <ol><li> t, 18 ㎕의 어닐링 믹스 μL 역 6 μl의 5 배 먼저 스트랜드 버퍼로 구성된 12 μL 마스터 믹스 (3 μL 0.1 M DDT, 1.2 ㎕의 25 배 AA-dUTP를 / 염기 믹스와 1.8를 추가 : 다음과 같이 역전사 효소 믹스를 준비ranscriptase (회사 만든 슬라이드 1 μL). 42 ° C에서 2-16 시간 동안 반응 믹스를 유지합니다. </li></ol></li></ol> 6. mRNA를 분해 및 cDNA를 정화 <ol><li> , 반응 혼합물로부터의 mRNA를 분해 약 15 분 동안 37 ° C에서 3 2.5 M의 NaOH μL과 장소를 추가합니다. 2M는 NaOH를 중화 유리 산을 HEPES의 후, 15 μl를 추가합니다. </li><li> PCR 정화 컬럼을 사용하여 cDNA의 혼합물을 정제하고 제조자의 프로토콜을 따른다. </li></ol> cDNA의 농도 측정 7. <ol><li> 분광 광도계에 cDNA의 농도를 측정한다. 라벨 계속하려면, cDNA를의 농도가 적어도 60 NG / μL (만든 슬라이드) 또는 20 NG / μL (회사 만든 슬라이드)되어 있는지 확인합니다. </li></ol> 아민 반응성 염료 및 정제와의 cDNA 8. 표지 <ol><li> cDNA의 레이블을 아민 반응성 염료를 사용합니다. 직접 하나 나누어지는 (5 μL)의로 cDNA를 혼합아민 반응성 염료를. </li><li> 60 ~ 90 분 동안 어두운 데에서, RT에서 혼합물을 부화 염료 표지 된 cDNA를 정제로 직접 진행. PCR 청소 열을 사용하여 제조 업체의 프로토콜에 따라 염료로 표지 된 cDNA를 정화. 용출 완충제에서 50 μL의 cDNA 용출. </li></ol> 표지 된 cDNA를 9. 측정 <ol><li> cDNA의 아민에 반응성 염료의 혼입을 측정하는 분광 광도계를 사용한다. 아민 반응성 염료의 농도가 50 μL의 총 부피에 적어도 0.5 pmol의 / μL가 있는지 확인합니다. </li></ol> 표지 된 cDNA를 샘플의 10 혼합 <ol><li> 만든 슬라이드를 들어, cDNA의 농도하게는 30 % 이상 차이가 하이브리드에 대한 모든 레이블의 cDNA를 사용합니다. 회사 만든 슬라이드를 들어, cDNA의 농도의 2 배 차이 이하로 cDNA를 사용합니다. 주 : 일반적으로, 유전자의 cDNA는 약 300 ng의 회사에서 만든 슬라이드 위해서 필요한 것이 REQ에 비해 약간 이는만든 슬라이드를위한 cDNA의 양을 uired. </li></ol> 11. 하이브리드 및 세척 <ol><li> (40 μL 효모 RNA와 수 제) 반은 물, 에탄올 99 %, SHY 버퍼 : 다음과 같은 시약을 사용합니다. SHY 최대 1 ml의를 준비합니다. </li><li> 장치 및 솔루션 준비 <ol><li> 건조하기 전에 진공 농축기와 히터 적어도 1 시간에 전환합니다. (45 ° C를 사용하여, S. 폐렴 DNA 마이크로 어레이에 대한) 정확한 하이브리드 온도로 조정 세트 포인트, 하이브리드 오븐에 전환합니다. 마찬가지로, 30 ~ 60 분 동안 하이브리드 카세트와 오븐을 예열. </li><li> 적어도 30 분 동안 68 ℃에서 SHY 버퍼를 예열한다. </li></ol></li><li> 샘플 준비 (의 cDNA를 표시) <ol><li> 표지 된 cDNA를 (최대 30 % 차이)의 동량을 결합합니다. 볼륨이보다 작은 7 μL 때까지 고온 (약. 40 분)에서 진공 농축기를 사용하여 샘​​플을 건조시킵니다. </li></ol></li><li> 리프터 미끄럼 <ol><li> 깨끗한 리프터 - 전표를 사용합니다.참고 : 30 μL 슬라이드에로드 할 수 있습니다 ±. </li><li> 비누, 수돗물 100 % 에탄올을 많이 리프터 - 전표를 청소합니다. 참고 : 더러운 리프터 전표가 높은 배경을 제공합니다. </li><li> 공기는 먼지 입자를 날려 공기 권총 리프터 - 전표를 건조. 측면에서 흰색 테프론 라이닝이 아래로 향하게하여 슬라이드에 깨끗한 리프터 슬립을 놓습니다. </li></ol></li><li> (표지 된 cDNA으로) 하이브리드 화 버퍼를 추가 <ol><li> 7 μL의 H 2 O에있는 말린 염료 샘플을 용해 2 분 동안 94 ℃에서 배양한다. </li><li> 즉시, 35 μL 예열 SHY 버퍼 (68 ° C)를 추가 침전물을 제거하는 1 분 동안 최대 속도로 부드럽게 회전 섞는다. 로딩 될 때까지 약 5 분 동안 68 ℃에서 프로브를 예열. </li></ol></li><li> 슬라이드 - 리프터 슬립 조립 및 예열. <ol><li> 50 ℃에서 열 블록에 하이브리드 슬라이드 홀더를 배치합니다. 가열 된 하이브리드 슬라이드 홀더 및 P에 리프터 미끄럼 방지와 DNA 마이크로 어레이 (microarray) 슬라이드를 배치분 리프터 - 슬립과 슬라이드를 재가열. 가능한 한 빨리 다음 단계를 수행합니다. </li><li> 슬라이드의 단부에 대상 시료 40 μL를 추가한다. 유체는 모세관 력에 의해 유리 표면 사이 흐르게. 천천히 조심스럽게 모든 피펫 팅을 수행합니다. </li><li> 항상 리프터 슬립 수평으로 슬라이드를 유지하고 리프터 미끄럼 이동하지 않았다는 것을 확인하기 위해 천천히 이동합니다. </li><li> 하이브리드 오븐에서 미리 예열 하이브리드 카세트를 가지고 시스템을 닫습니다. 장소 필터 종이는 하이브리드 카세트에서 3 ml의 2 배 SSC (표준 식염수 구연산)로 적셔. </li><li> 조심스럽게 하이브리드 카세트에서 슬라이드와 하이브리드 슬라이드 홀더를 배치합니다. 하이브리드 카세트를 닫고 (약 16 ~ 18 시간 동안) 오븐 다시 하이브리드에 넣어. </li></ol></li><li> 슬라이드 세척 <ol><li> I, II 및 III 신선한 세척 - 버퍼 (세척 단계 750 ml)에 준비합니다. (500)는 I를 버퍼를 씻어 ML를 들어, 2 × SSC / 0.5 % SDS를 사용합니다. 500 워시 - 버프를 ㎖로어 II는 1 × SSC / 0.25 % SDS를 사용합니다. 500 ml를 들어 세척 버퍼 III를 사용하는 1 × SSC / 0.1 % SDS (선택 사항) </li><li> 30 ° C에서 세척 - 버퍼를 놓고 (확인하기 위해 SDS는 용해). </li><li> 유리 튜브의 원뿔 바닥에 닿을 때까지 50 ㎖로 채워진 팔콘 튜브에 매우 부드럽게 가능한 한 빨리 슬라이드 잠수함,하지만 난 버퍼를 씻는다. </li><li> 상기 튜브의 하단에 미끄럼 리프터 싱크가 배열 긁힘없이 핀셋 슬라이드를 꺼내 세정제의 선반에 넣고 몇 초 후. 짧은 시간 간격으로 세척를 계속합니다. </li><li> 세척 버퍼를 ㎖로 I (세척 역에서) 500에서 5 분 동안 슬라이드를 씻으십시오. 세척 버퍼 ㎖로 500에 20 ~ 30 분 (세척 역) II를 위해 두 번째 씻어주세요. 마찬가지로, 세척 버퍼 ㎖로 500에 5 분 동안 슬라이드를 씻어 III (선택 사항) (세척 역). </li><li> 2,000 rpm에서 2 분 동안 슬라이드를 건조시킵니다. </li></ol></li></ol> 12. 마이크로 어레이 분석 <ol><li> 이미지를 스캔와 스캐너에서 각각의 파장의 폴더 &quot;주피터 프로젝트&quot;에 저장합니다. </li><li> 이 소프트웨어를 실행 한 후 이전에 22 설명 된 바와 같이 처음에 스캔 된 파일을 분석하는 소프트웨어를 사용하여, &quot;레드&quot;와 녹색 이미지 파일 (-.635)로 빨간색 이미지 파일 (-.550)을로드하려면 &quot;이미지 열기&quot;탭을 선택 &quot;녹색&quot;. 탭 (22)을 &quot;로드 배열 목록&quot;을 선택하여 이미지 파일에 S. pneumoniae에 배열 목록을 갖는 걸 파일 (.gal)를 업로드합니다. 참고 :이 배열 목록, 48 그리드로 구성되어 각 격자에 16 행 15 열의가 있었다. 그리드의 각 지점은 하나의 유전자를 나타내는 유전자 이름을 포함하여 장소 정보는 현장 설명 파일을 통해 추가됩니다. 지점 번호는 왼쪽에서 오른쪽으로, 위에서 아래로부터 제공됩니다. </li><li> 조심스럽게 그리드를 선택 탭에 얼룩을지게 한 후 지점을 정렬 &quot;기능을 정렬 블록을 찾아, 배열 찾기&quot;. 모든 기능을 정렬 한 후, &quot;분석&quot;t를 선택하여 이미지를 분석AB. 결과, 히스토그램과 산포도를 갖는 새로운 파일을 만듭니다. &quot;다른 이름으로 저장 결과&quot;탭에서이 파일을 저장 추가 분석을 위해 .gpr 파일로 저장됩니다. </li><li> 9 바와 같이 자체 개발 Microprep 소프트웨어 패키지와 상기 정규화 데이터의 처리를 수행한다. </li><li> 염료 스왑 DNA 마이크로 어레이 데이터에 대한 독립적 인 생물학적 반복 실험을 사용합니다. 같은 t-TEST1의 변형의 CyberT 구현을 수행하고 계산 거짓 발견 비율 (FDRs)는 9 설명했다. </li><li> 발현 된 유전자, 표준 p &lt;0.001 FDR &lt;0.05를 취할. </li><li> GEO (유전자 발현 옴니버스) 가입 번호를 얻기 위해 NCBI 제출 페이지에 DNA 마이크로 어레이 데이터를 업로드합니다. </li></ol>

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	<li>Kayala, M. A., Baldi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyber-T+web+server:+differential+analysis+of+high-throughput+data.">Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data.</a> Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).</li><li>Chang, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+cells+to+matrixes+of+distinct+antibodies+coated+on+solid+surface.">Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface.</a> J. Immunol. Methods. 65, 217-223 (1983).</li><li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+monitoring+of+gene+expression+patterns+with+a+complementary+DNA+microarray.">Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.</a> Science. 270, 467-470 (1995).</li><li>Galau Levi, A., A, G., Wetzstein, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+procedure+for+the+isolation+of+RNA+from+high-phenolic-containing+tissues+of+pecan.">A rapid procedure for the isolation of RNA from high-phenolic-containing tissues of pecan.</a> 27 (12), 1316-1318 (1992).</li><li>Lopez-Gomez, R., Gomez-Lim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+extraction+of+intact+RNA+from+fruits+rich+in+polysaccharides+using+ripe+mango+mesocarp.">A method for extraction of intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp.</a> (5), 440-442 (1992).</li><li>Salzman, R. A., Fujita, T., Salzman, Z., Hasegawa, P. M., Bressan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+improved+RNA+isolation+method+for+plant+tissues+containing+high+levels+of+phenolic+compounds+or+carbohydrates.">A improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates.</a> Plant Molecular Biology Report. 17, 11-17 (1999).</li><li>Kiefer, E., Heller, W., Ernst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+protocol+for+isolation+of+functional+RNA+from+plant+tissues+rich+in+secondary+metabolites.">A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites.</a> Plant Mol. Biol. Report. 18, 33-39 (2000).</li><li>Tattersall, E. A. R., Ergul, A., Alkayal, F., Deluc, L., Cushman, J. C., Cramer, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methods+for+isolating+high-quality+RNA+from+leaves+of+grapevine.">Comparison of methods for isolating high-quality RNA from leaves of grapevine.</a> Am. J. Enol. Vitic. 56, 400-406 (2005).</li><li>Van Hijum, S. A. F. T., Garcia de la Nava, J., Trelles, O., Kok, J., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroPreP:+a+cDNA+microarray+data+pre-processing+framework.">MicroPreP: a cDNA microarray data pre-processing framework.</a> Appl.Bioinformatics. 2, 241-244 (2003).</li><li>Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors+in+host+respiratory+colonization+and+disease.">The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease.</a> Nat.Rev.Microbiol. 6, 288-301 (2008).</li><li>Afzal, M., Shafeeq, S., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LacR+is+a+repressor+of+lacABCD+and+LacT+is+an+activator+of+lacTFEG,+constituting+the+lac+gene+cluster+in+Streptococcus+pneumoniae.">LacR is a repressor of lacABCD and LacT is an activator of lacTFEG, constituting the lac gene cluster in Streptococcus pneumoniae.</a> Appl. Environ. Microbiol. 80, 5349-5358 (2014).</li><li>Afzal, M., Shafeeq, S., Henriques-Normark, B., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UlaR+activates+the+expression+of+the+ula+operon+in+Streptococcus+pneumoniae+in+the+presence+of+ascorbic+acid.">UlaR activates the expression of the ula operon in Streptococcus pneumoniae in the presence of ascorbic acid.</a> Microbiol. Read. Engl. , (2014).</li><li>Hendriksen, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+contributions+of+glutamine-dependent+regulator+GlnR+and+GlnR-regulated+genes+to+virulence+of+Streptococcus+pneumoniae.">Site-specific contributions of glutamine-dependent regulator GlnR and GlnR-regulated genes to virulence of Streptococcus pneumoniae.</a> Infect. Immun. 76, 1230-1238 (2008).</li><li>Kloosterman, T. G., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+arginine+acquisition+and+virulence+gene+expression+in+the+human+pathogen+Streptococcus+pneumoniae+by+transcription+regulators+ArgR1+and+AhrC.">Regulation of arginine acquisition and virulence gene expression in the human pathogen Streptococcus pneumoniae by transcription regulators ArgR1 and AhrC.</a> J. Biol. Chem. 286, 44594-44605 (2011).</li><li>Kloosterman, T. G., Bijlsma, J. J. E., Kok, J., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+have+neighbour's+fare:+extending+the+molecular+toolbox+for+Streptococcus+pneumoniae.">To have neighbour's fare: extending the molecular toolbox for Streptococcus pneumoniae.</a> Microbiol. Read. Engl. 152, 351-359 (2006).</li><li>Blom, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIVA:+Functional+Information+Viewer+and+Analyzer+extracting+biological+knowledge+from+transcriptome+data+of+prokaryotes.">FIVA: Functional Information Viewer and Analyzer extracting biological knowledge from transcriptome data of prokaryotes.</a> Bioinforma. Oxf. Engl. 23, 1161-1163 (2007).</li><li>Blom, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prosecutor:+parameter-free+inference+of+gene+function+for+prokaryotes+using+DNA+microarray+data,+genomic+context+and+multiple+gene+annotation+sources.">Prosecutor: parameter-free inference of gene function for prokaryotes using DNA microarray data, genomic context and multiple gene annotation sources.</a> BMC Genomics. 9, 495 (2008).</li><li>Blom, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DISCLOSE+:+DISsection+of+CLusters+Obtained+by+SEries+of+transcriptome+data+using+functional+annotations+and+putative+transcription+factor+binding+sites.">DISCLOSE : DISsection of CLusters Obtained by SEries of transcriptome data using functional annotations and putative transcription factor binding sites.</a> BMC Bioinformatics. 9, 535 (2008).</li><li>Baerends, R. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome2D:+a+visualization+tool+for+the+rapid+analysis+of+bacterial+transcriptome+data.">Genome2D: a visualization tool for the rapid analysis of bacterial transcriptome data.</a> Genome Biol. 5 (5), R37 (2004).</li><li>De Jong, A., Pietersma, H., Cordes, M., Kuipers, O. P., Kok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PePPER,+a+webserver+for+prediction+of+prokaryote+promoter+elements+and+regulons.">PePPER, a webserver for prediction of prokaryote promoter elements and regulons.</a> BMC Genomics. 13, 229 (2012).</li><li>Lanie, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+Avery's+virulent+serotype+2+strain+D39+of+Streptococcus+pneumoniae+and+comparison+with+that+of+unencapsulated+laboratory+strain+R6.">Genome sequence of Avery's virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6.</a> J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).</li><li>Molecular Devices, Corp. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners-Use's Guide and Tutorial. , (2005).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 금융 이익이 없다는 것을 선언합니다.

우리는 세균의 전체 전 사체 분석을 수행하도록 적용될 수있는 사용자 친화적 인 프로토콜을 설명한다. 이러한 특정 기법에 대한 핵심은 세포가 수확되는 조건에 따라 달라질 것이다. 세포 RN​​A 분리 및 수확 후,이 기술은 박테리아 샘플 모든 유형과 정확히 동일하게 동일한 절차를 따르며, 따라서 세균 배양의 모든 유형에 적용 할 수있다. 이 프로토콜은 매우 간단하고 편리하고 RNA 분리에서 ?...

유전자 과발현 또는 녹 - 아웃을 포함하여, 특정 시간 또는 특정 조건 하에서 단세포 생물 또는 진핵 세포의 게놈에 의해 코딩 mRNA의 풍부 (사체)의 전체 세트의 연구는 transcriptomics 불린다. Transcriptomics 우리가 어느 정도 유전자 시점 X에서 특정 조건에서 발현되는 무엇을 관찰 할 수 있습니다 우리에게 유전자에 대한 참조를 기준으로 표시하는 방법을 강하게에 대한 정보를 제공합니다. 마이크로 어레이는 고체 기판 상에 2 차원 어레이 (일반적으로 유리 슬라이드 또는 실리콘 박막 셀) 높은 처리량 스크리닝을 사용하여 생체 물질의 대량 분석하는 데 사용하고, 소형화 될 수 있고, 다중화 및 병렬 프로세싱 및 검출이며 방법. 마이크로 어레이는 DNA-마이크로 어레이, 단백질 마이크로 어레이, 펩티드 마이크로 어레이, 조직 마이크로 어레이, 항체 마이크로 어레이, 세포 마이크로 어레이 등을 비롯한 다양한 형태로 왔습니다. DNA 마이크로 어레이는기본적 미세한 DNA 스폿의 조립체는 고체 표면에 고정 된 보통 유리. DNA 마이크로 어레이는 유전자의 발현 수준 또는 유전자의 동시 측정하는 세트 또는 게놈 2,3- 복수의 영역의 유전자형을 위해 사용된다. 프로브 Picomoles (10-12 몰) 또한 리포터로 알려진 특정 DNA 서열을 나타내며, 각각의 DNA 스폿 내에 존재한다. 샘플에서 라벨의 mRNA 분자는 &#39;목표&#39;라고합니다. 형광 프로브는 표적과 혼성화 형광 표지 된 표적의 검출을 측정하는 데 사용되는 것은 타겟 핵산 서열의 상대적인 풍부함을 결정한다. 배열 수십 프로브의 수천을 포함 할 수 있기 때문에 마이크로 어레이 실험은 병렬로 여러 유전자 검사를 수행 할 수 있습니다. 간단한 마이크로 어레이 실험의 배치는 그림 1에 나타나있다. 최근에는 이러한 배열은이 기술을 매우 비용 effectiv을 만드는, 재사용하는 것이 우리와 다른 실험실에서 설립되었다전자. 8 - 다른 RNA의 분리 및 정제 기술은 C-TAB, SDS와 GT 방법 4를 포함하여 수년에 걸쳐 개발되고있다. 또한, 여러 상업 키트도 사용할 수 있습니다. 유전자 발현을위한 고품질의 RNA는 매우 중요합니다. 따라서, RNA 분리 방법은 RNA의 최대 양을 얻기 위해 수정됩니다. 마찬가지로, cDNA를 cDNA를 준비 및 라벨링에 대한 단계는 최소화된다. 스캔 한 후 데이터의 정규화는 또한 자체 내장 된 소프트웨어 패키지 및 도구 (9)를 사용하여 효율적으로 수행된다. 폐렴 구균은 비 인두를 식민지화과 폐렴, 패혈증, 중이염 등의 여러 감염의 원인 10 뇌막염 그람 양성 인간 병원체이다. 박테리아의 성장과 생존에 필요한 11,12 영양소 다양한 이용할 수있다. 연구 번호에 대해 수행 된아미노산의 중요성 및 병독성 13,14에서의 역할을 강조 폐렴 질소 대사 조절. 본 연구에서는 미국의 transcriptomic 응답 폐렴 L 세린, 인간 혈장에 존재하는 다량의 아미노산의 농도 변화에 DNA 마이크로 어레이를 사용하여보고된다. S.의 transcriptomic 응답 세린 L (150 μM)의 농도를 최소 성장 폐렴은 세린의 최대 농도 (10 mM)을 성장에 비해 하였다. 화학적으로 정의 된 배지 (CDM 또는 최소 배지) 15 세린의 농도를 제어하기 위해이 연구를 위해 사용되었다. 본 연구의 초점이 기술은 사용자 친화적 있도록 정상화 데이터 및 분석을위한 다른 도구를 제공하는 것이다. 따라서, 공구의 수는 분석 데이터 해석을 위해 개발되었다. FIVA (기능 정보 뷰어 및 분석기)을 갖는 유전자의 클러스터에 포함 된 정보 처리를위한 플랫폼을 제공합니다유사한 유전자 발현 패턴 및 기능 정보 (16)를 구성하기위한. 검사는 추정되는 기능 및 유전자 주석 (17)의 식별을 용이하게 다른 소프트웨어 패키지이다. 클러스터링 방법을 이용하여 공개는 DNA 결합 부위 검출 알고리즘을 제공한다. 유전자의 시스 - 규정 모티프이 알고리즘 (18)을 통해 투영 될 수있다. Genome2D는 게놈 맵 (19) 상에 유전자 발현 수준의 변화를 특성화하기 위해 상이한 컬러 범위를 제공함으로써 시각화 및 사체 데이터의 분석을위한 윈도우 기반 플랫폼을 제공한다. 고추 웹 서버는 모든 -에 - 하나의 분석 방법, regulons, 프로모터 및 전사 인자 결합 부위 (20)에 대한 마이닝 도구 상자에 추가로 제공합니다. 박테리아 게놈 유전자 간 영역의 전체 주석이 패키지를 사용함으로써 달성 될 수있다. 이 실험을 설계하는 그들에게 플랫폼을 제공으로 생물 학자들은 크게 고추 혜택을 누릴 수 있습니다(S)이되도록 가정 된 생체 정보 (20)에서 확인할 수있다. 대부분이 무료로 사용할 수 있습니다 및 데이터 표준화 및 분석은 매우 신뢰성있는 이러한 소프트웨어 패키지는 마이크로 어레이 분석에 크게 기여하고 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid phenol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P4682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche RNA isolation kit</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>11828665001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td></td>
			<td>105015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Boom</td>
			<td>92013505.1000.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAA</td>
			<td></td>
			<td>106630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ND-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent BioAnalyser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2940CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AA-dUTP</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>AM8439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDT</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First Strand buffer</td>
			<td>Life technologies Invitrogen</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>S8045-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight-550</td>
			<td>Thermoscientiffic</td>
			<td>62262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight-650</td>
			<td>Thermoscientiffic</td>
			<td>62265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHY Buffer</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>H7033-125ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speedvac cooler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>RUGNE3140</td>
			<td>Speedvac concentrator plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Grant Boekel</td>
			<td>Iso-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifter-slips</td>
			<td>Erie Scientific</td>
			<td>25x60I-M-5439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wipe</td>
			<td>KIMTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>L3771-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>W302600-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genpix autoloader 4200A1</td>
			<td>MSD analytical technologies</td>
			<td></td>
			<td>Microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>104766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fast and reliable pipeline for bacterial transcriptome analysis case study: serine-dependent gene regulation in streptococcus pneumoniae

유전자 발현 및 조절은 반응 조건이 다른 셀들의 동작을 이해하는 것이 매우 중요하다. 다양한 기술이 유전자 발현을 연구하기 위해 현재 사용되지만, 대부분의 전 사체의 발현을 제공하는 전체 화상의 관점에서 제한된다. DNA 마이크로 어레이는 전체 유전자 발현의 전체 개요를 제공 빠르고 경제적 연구 기술을 제공하고 수천을 분석하는데 도움도 사이트, 세포의 전사 활성의 특성화 및 바인딩 신규 유전자 전사 인자의 확인을 포함하여 광범위한 응용 번호를 가지고 유전자 (하나의 실험에서). 본 연구에서, DNA 마이크로 어레이 분석 세포 수확에서 세균 전 사체 분석을위한 조건이 최적화되어있다. 계정으로 시간, 비용과 실험의 정확성을 촬영,이 기술 플랫폼은 세균 transcripto 연구를위한 매우 유용하고 보편적 applicabale 것으로 입증MES. 여기서 우리는 S.의 전사 반응을 비교하여 대소 연구 등의 폐렴 구균과 DNA 마이크로 어레이 분석을 수행 폐렴 L 배지에 세린의 다양한 농도의 존재 하에서 성장. 총 RNA는 RNA의 품질 검사 키트를 사용하여 조사 하였다 RNA 분리 키트 및 RNA의 품질을 사용하여 Macaloid 방법을 사용하여 단리 하였다. cDNA를 역전사 효소를 사용하여 제조하고, cDNA를 시료는 두 아민 반응성 형광 염료 중 하나를 사용하여 라벨링 하였다. 제 DNA 마이크로 어레이 슬라이드의 cDNA 마이크로 어레이 데이터 전처리 워크 (Microprep)를 사용하여 분석 하였다 표지 된 cDNA 샘플 및 마이크로 어레이 데이터의 혼성화에 사용 하였다. 마지막으로 사이버 T는 통계적으로 유의 한 발현 된 유전자의 식별 Microprep을 이용하여 생성 된 데이터를 분석하는데 사용 하였다. 또한, 자체 내장 된 소프트웨어 패키지 (고추, FIVA는 공개, 검사, Genome2D)를 분석하는 데 사용되었다데이터.

RNA, cDNA를 절연 부 및 분석 L 세린은 필수 아미노산의 하나이며, 인간의 혈장 농도는 아동 및 성인에서 60-150 μM 다르다. 퓨린과 피리 미딘의 생합성의 역할은 신진 대사의 중요성을 강조하고 여러 아미노산 (글리신, 시스테인 및 트립토판)의 전조이다. S. 전체 사체에 L 세린의 영향을 연구 폐렴 D39 야생형 균주, 동일한 배지에서 최대 농도 (10 mM)을 그 ?...

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A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.

세균의 사체 분석 사례 연구에 대한 빠르고 안정적​​인 파이프 라인 : 세린에 의존하는 유전자 조절에<em&gt; 폐렴 구균</em

Gene expression and its regulation are very important to understand the behavior of cells under different conditions. Various techniques are used nowadays ...

a-fast-reliable-pipeline-for-bacterial-transcriptome-analysis-case

Research

JoVE Journal

Biology

A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

10.3K 조회수.  University of Groningen. This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages. 

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Microarrays을 사용하여 세균의 유전자 발현 분석

연구

생물학

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

활성 T.의 체외의 Reconstitution에서 castaneum의 Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리<em&gt; 체외에서</em&gt; mRNA 함께 Translational 일시 중지 사이트를 식별하려면

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Ribosome 바운드 Polypeptides을 파악하는 도구로 SecM 체포 시퀀스를 사용하여

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

게놈 전체 유전자 삭제할에<em&gt; 연쇄상 구균 sanguinis</em&gt; 높은 처리량 PCR에 의한

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

배양 된 포유 동물 세포의 생물 학적 경로의 유비퀴틴과 유비​​퀴틴 같은 시스템 레귤레이터를 확인하는 siRNA를 상영

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

세균 커뮤니티 특성화에 대한 효율적인 핵산 추출 및 16S rRNA의 유전자 시퀀싱

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

대한 유전 및 생화학 적 접근<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 체외</em&gt; 단백질 올리고머의 평가 다음 Ryanodine 수용체 사례 연구

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus on one or more gene families that are significant to the organism and study. In this protocol, we outline bioinformatic steps to generate a phylogeny and to quantify the expression of genes of interest. Phylogenetic trees can give insight into how genes are evolving within and between species as well as reveal orthology. These results can be enhanced using RNA-seq data to compare the expression of these genes in different individuals or tissues. Studies of molecular evolution and expression can reveal modes of evolution and conservation of gene function between species. The characterization of a gene family can serve as a springboard for future studies and can highlight an important gene family in a new genome or transcriptome paper.

The purpose of this protocol is to investigate the evolution and expression of candidate genes using RNA sequencing data.

RNA-seq를 사용하여 분자 진화 및 유전자 발현을 조사하기 위한 생물정보학 파이프라인

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

세균의 사체 분석 사례 연구에 대한 빠르고 안정적​​인 파이프 라인 : 세린에 의존하는 유전자 조절에

세균의 사체 분석 사례 연구에 대한 빠르고 안정적인 파이프 라인 : 세린에 의존하는 유전자 조절에