This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).

1. 플라이 문화, 솔루션 및 배아의 취급 장치의 제조 <ol><li> 초파리의 가두리를 준비합니다. 10cm 포도 한천 플레이트 효모 붙여 넣기의 자리가 장착 된 인구 케이지에서 원하는 변형 500 + 짝짓기 파리를 놓습니다. 25 ° C의 습도 조절 배양기에서 문화를 유지한다. 주 : &#160; 케이지 문화가 일치 배아 누워 패턴을 얻기 위해 에어컨의 하루 이틀이 필요합니다. 효모 붙여 넣기 포도 플레이트를 조절하는 동안 아침에 한 번 저녁에 한 번 변경됩니다. </li><li> EPS를 준비합니다. 37 ° C에서 계면 활성제 (코카 미드 DEA 및 에톡 시화 알콜)의 따뜻한 솔루션 피펫 작은 교반 막대가 구비 된 유리 신틸레이션 바이알에, D-리모넨 18 밀리리터. 피펫 D-리모넨에 1 ㎖의 두 계면 활성제 (각 5 % 최종 농도)의 각. 철저하게 혼합 및 교반 막대를 제거합니다. 주 : EPS의이 원액은 실온에서 약 2 달을 위해 좋다. 솔루션37 ° C 올라가면 완전히 사용하기 전에 계면 활성제를 용해하는 소용돌이해야합니다. 그들은 시간이 지남에 따라 일부의 플라스틱을 용해하므로 EPS 및 D-리모넨은 유리 용기에 저장되어야한다. </li><li> 배아 dechorionation 솔루션, 배양 매체, 염료 및 약물 솔루션을 준비합니다. 25 ML의 H 2 O와 얕은 접시에 장소 표백제 25 ㎖를 혼합한다. 이전의 레시피 1,12에 따라 수정 기본 배양 배지 (MBIM) 및 MBIM-T를 준비합니다. 방패를 준비하고 (자료 목록을 참조하십시오) 제조 업체의 프로토콜에 따라 M3 세포 배양 배지와 PBS를 불렀다. DMSO에 10 mM의 농도에서 permeabilization 염료의 주식 솔루션을 준비합니다. </li><li> 배아 처리 장치 및 소모품을 조립 : <ol><li> dechorionation 및 EPS 처리 바구니 (그림 1A 참조) 준비합니다. 미세 톱니 보았다 일회용 50 ㎖ 폴리 프로필렌의 원심 분리기 / 문화 튜브의 3cm 부분을 잘라. 부착 사포의 튜브 부분을 문질러서 용접 표면 세척을벤치 탑 표면에. 용접 불꽃 위에 튜브 섹션의 림을 용융 유리 접시에 메쉬에 눌러 Nitex 나일론 메쉬 튜브 섹션. 식지 여분의 메쉬를 트림. 참고 : 깎아 지른듯한 측면과 하단은 각각의 단계에서 잔류 표백제 EPS 떨어져 신속하고 완벽한 세척을 위해 수 있습니다. 용접 단계 흄 후드에서 수행되어야한다. </li><li> 개발 바구니를 준비합니다. 뚜껑의 가장자리와 같은 높이가 50 ㎖ 원심 분리기 / 문화 튜브의 상단 부분을 잘라. 제거 및도 1b에 도시 된 바와 같이 림을 따라 중앙 개구부와 노치를 절단하여 캡을 수정한다. 메시에와 차단 튜브 섹션의 스레드 캡 나사 및 여분의 메쉬 트림. 참고 : 캡은 60mm 저수지 접시 (그림 1B &#39;)에 위치 할 때 대량 매체에 확산을 허용하는 테두리에 노치가 포함되어 있습니다. </li><li> 슬라이드 챔버의 구성 요소를 준비합니다. 보다 큰 DO 막 사각형을 잘라슬라이드 챔버 개방. 개구부의 내부 입술에 진공 그리스의 매우 얇은 층을 적용하십시오. 리테이너 링 그리스에 대해 그것을 밀봉 구멍에 DO 막 부착합니다. 가까운 리테이너 링을 다시 절단하여 초과 DO 막 트림. 참고 :. 슬라이드 챔버에 대한 사양 Kiehart 등 13에서 찾을 수 있습니다이 챔버는 상업적으로 사용할 수 없습니다 및 기계 상점에 의해 정의 제조가 필요합니다. </li></ol></li></ol> 2. 준비, Dechorionation 및 태아의 EPS 치료 <ol><li> 시간을 재는 수집에 의해 배아를 준비. AM의 비행 문화 케이지에 신선한 포도 / 효모 판을 설정합니다. 배아가 25 ℃에서 1 시간 동안 배치 할 수 이 판을 취소하고 25 ℃에서 2 시간의 후속 배아 누워에 대한 신선한 포도 / 효모 플레이트로 교체 또한 개발 준비를위한 18 ° C의 배양기에서이 판과 장소를 수집합니다. 주 : 25 ° C에서의 개발의 1 시간은 개발의 2 시간과 동일18 ° C에서 최종 단계의 배아에서 EPS의 permeabilization을 유지하는 25 ° C에 비해 18 ° C에서 노화의 효과는 그림 2에서 볼 수 있습니다. </li><li> Dechorionation. 조심스럽게 25 ° C의 수돗물과 붓을 사용하여 메쉬 바구니에 포도 판의 오프 배아를 씻어. 멀리 수돗물의 부드러운 스트림에서 바구니에 배아를 초과하는 효모를 씻어. 2 분 동안 50 %의 표백제에 바구니를 담근다. 철저하게 수돗물의 흐름에 따라 배아를 씻으십시오. 참고 : 부드럽게 간헐적으로 플라스틱 피펫을 사용하여 배아에 표백제 용액을 분출. 2 분 완료 dechorionation 보통 충분하지만,이 배양 시간은 직접 검사에 의해 확인하고 그에 따라 조정되어야한다. 수돗물에 침지 바구니에 dechorionated 배아를 유지하고 EPS 단계로 바로 진행합니다. </li><li> EPS 치료 <ol><li> 각 PBS의 약 10 ㎖로 여섯 60mm 요리를 준비합니다. 2.925 ㎖의 MBI에 75 μL의 EPS를 용해하여 EPS 희석을 준비소용돌이와 함께 50 ㎖ 유리 비이커 M (1시 40분). 참고 :이 혼합물에서 화이트 에멀젼 형태. </li><li> 닦아 실험실과 메쉬 바구니의 바닥에서 여분의 물을 더 럽히. 비커에 희석 EPS에 바구니를 담그고 즉시 바구니의 바닥에있는 EPS 용액에 배아를 분산 소용돌이 친다. 30 초 동안 동작을 소용돌이 계속합니다. NOTE : EPS 희석 및 노출 시간은 투과성을 제어하도록 변할 수있다. 그것은 최적의 EPS 희석 및 처리 시간이 사용중인 파리의 변종으로 경험적으로 확립하는 것이 좋습니다. 60-90 초의 노출 시간을 증가 시키면 스테이지 (12)와 세 배아 유리하다. </li><li> 바구니를 제거 닦아 랩으로 초과 EPS를 멀리 얼룩. 60mm 요리에 PBS 10 ㎖ 여섯 연속 세척을 진행합니다. 부드럽게 여섯 씻어 각 PBS와 배아를 분출하기 위해 플라스틱 피펫을 사용합니다. 염색 진행 및 약물 치료의 단계. 주 : EPS는 싱크대 아래로 배치 될 수있다. </li></ol></li></ol>Permeabilized 태아의 3. 염료와 약물 치료 <ol><li> 염료 치료 <ol><li> 10 mM의 CY5 카르 복실 산 염료 * 1.5 ML의 microfuge 튜브와 혼합하는 소용돌이에 MBIM-T (50 μM 최종 농도)의 ML 1의 5 μl를 추가합니다. 주 : * 염료의 선택은 다운 스트림 분석에 따라 달라집니다. CY5 카르 복실 산 고정 및 면역 염색을 사용하여 이후의 분석에 효과적입니다. 로다 민 B는 살아있는 배아의 분석에 유용합니다. 로다 민 B의 적색 발광, 그 대사 산물 (1)의 녹색 발광 형광을 사용하여 다운 스트림 응용 프로그램과 몇 가지 합병증을 표시 할 수 있습니다. 약물 또는 독소는이 단계에서 치료를 시작하기 위해, 또는이 단계에서 펄스 ​​약물 / 독소 처리를 제한하는 염료 용액에 첨가 할 수있다. 케어 MSDS 및 환경 안전 표준에 따라 처리하고 약물과 독소를 처리하기 위해주의해야한다. </li><li> 붓을 사용하여 염료 용액에 메쉬 바구니에서 배아를 전송합니다. 튜브 캡을 보장하기 위해 반복적으로 반전배아는 염료 용액에 현탁 자유롭게 떠. 실온에서 15 분 동안 경동 로커에 튜브를 놓습니다. </li><li> nutator에서 튜브를 제거하고 배아가 정착 할 수 있습니다. 미세 피펫 염료 용액을 제거하고 씻어 MBIM-T 1 ㎖​​로 대체합니다. 완전히 배아를 다시 일시 중단 튜브를 반전. 배아가 정착하자 및 3 개의 MBIM-T 세척으로 반복합니다. 마지막 헹굼에서 모든 MBIM-T를 제거하고 배양 단계로 진행합니다. </li></ol></li><li> 배아 개발을위한 인큐베이션 <ol><li> 개발 바구니 또는 슬라이드 실 : 두 개의 챔버 중 하나에 배아를 전송합니다. NOTE : 개발 바스켓 이상 발달 동안 바람직하고, 후속의 고정 및 면역 염색 단계가 실행되는 경우에 필요하다. 슬라이드 챔버는 높은 해상도 시간 경과 이미징을위한 최적 짧은 개발 기간 (예를 들어, 초기 배아 이벤트)에 가장 효과적이다. 약물이나 독소는 다양한 농도와 배아 D에서 배지에 첨가 할 수있다evelopment 표준 고정을 사용하여 프로토콜을 면역 염색 라이브 배아 또는 엔드 포인트에서 실시간으로 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 바구니 개발 <ol><li> 70 % 에탄올로 분출에 의해 개발 바구니를 청소, 탈 이온수로 깨끗이 씻어 닦아 실험실로 건조시킨다. 약물이나 독소를 원하는 농도로 배양 배지 6 ㎖를 준비합니다. 메쉬베이스에서 60mm 접시 돌보는에 트래핑하지 기포의 매체에 개발 바구니를 놓습니다. 참고 : 두 개의 미디어가 일반적으로 사용되는 : 50:50 혼합물 혼자 MBIM, 또는 MBIM/M3, 후자는 긴 개발 기간 동안 더 효과적. </li><li> 페인트 브러시와 바구니의베이스 표면 메시 permeabilized 배아를 전송합니다. 조심스럽게 주변 저수지에서 미디어와 배아를 분출. 그들은 메시에 단일 층에 있도록 페인트 브러시와 배아를 분산. 주 : 현미경 영상을 진행하고 홍보의 permeabilization과 생존 특성을 평가eparation (단계 4 참조). </li></ol></li><li> 슬라이드 챔버 개발 <ol><li> 슬라이드 실 전환 및 개구부의 둘레에 진공 그리스의 작은 구슬을 적용합니다. 오프닝 내 DO 막의 표면에 약물 또는 독소의 원하는 양의 매체 150 μl를 놓습니다. 참고 : 두 개의 미디어가 일반적으로 사용되는 : 50:50 혼합물 혼자 MBIM, 또는 MBIM/M3, 후자는 긴 개발 기간 동안 더 효과적. </li><li> 페인트 브러시와 미디어의 하락 permeabilized 배아를 전송합니다. 그들이 드롭 내 막에 정착하는 배아를 분산. </li><li> 조심스럽게하여 매체를 평평 입구에 25mm 원형 커버 슬립을 적용합니다. 그리스와 인감을 형성하는 커버 슬립의 주변을 따라 부드럽게 누르십시오. 주 : (4 단계 참조) 준비 permeabilization과 생존 특성을 평가하기 위해 영상을 현미경로 이동합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. IdentiPermeabilized 실행 가능한 태아의 문법을 없애는 <ol><li> permeabilized 배아를 식별합니다. 디지털 카메라를 탑재하여 표면 형광 현미경 하에서 배아를 관찰한다. 고정 현미경과 카메라 설정을 사용하여 여러 필드 (프로파일 노른자 형광도를 결정하기 위해 파란색 파장) 이미지를 획득. </li><li> 상대 형광 강도에 따라 배아의 permeabilization를 결정합니다. 바구니를 수용하고 배아의 조작을 할 수 있도록 큰 작동 거리와 입체 현미경을 사용합니다. 현미경은 프로그램 XYZ 스테이지, 표면 형광 조명 및 디지털 카메라가 장착되어야한다. 이미지는 나중에 지점에서 동일한 배아의 재평가를 가능하게 노출하고 각 배아 이미지의 무대 위치 매개 변수를 기록 돌보는 배아 (그림 3의 대표적인 결과 참조). 주 : 염료의 흡수 패턴은 사용 된 염료, 노출과 태아 연령의 길이에 따라 달라집니다. 넓은 범위의하나의 준비에서의 염료의 흡수는 전형적인하고 permeabilization의 정도의 변화를 반영한​​다. </li><li> 가능한 배아를 식별합니다. permeabilized 배아의 위치를​​ 표시 한 후, 실내 온도 25 ℃에서 배아 발달과 함께 계속 현미경 바구니 또는 슬라이드 챔버를 반환합니다. 파랑 채널 형광에서 관찰하고 이전에 확인 된 permeabilized 배아의 노른자 형광도의 이미지를 획득. 노른자 분포의 정상적인 진행에 따라 생존 능력을 평가 (랜드 등. 1과 그림 3의 대표적인 결과 참조). 주 : 명 시야 현미경으로 관찰 배아의 다른 형태의 특징 생존력을 평가하기 위해 사용될 수있다. 그것은 생존과 호환되는 투과성의 수준을 설정하면 각각의 염료 사용 파리의 변형으로 경험적으로 결정하는 것이 좋습니다. </li><li> permeabilized 가능한 배아 약물 또는 독소의 효과를 평가합니다. </li><li> proce 배아위의 프로토콜은 기존의 번호를 태세와 ssed은 약물이나 독소에 노출 이후의 분석. 분석의 여러 유형 중 일부는 아래의 설명에서 고려 직접 라이브 배아의 형태 형성의 관찰뿐만 아니라 사후 고정 면역 염색 분석을 포함한다. 이러한 방법은 모두 유전자 발현 패턴과 세포 계통 및 형태학 프로파일을 계시 중요한 염료 (예를 들면, GFP)을 사용하여 강화된다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

위의 방법은 다양한 개발 범위에 걸쳐 작은 분자 치료에 접근 가능한 Drosophila의 배아를 획득 할 수있는 방법을 설명합니다. 이 방법은 이전에는 초기 단계의 배아에서와 같이 18 ° C에서 배아를 노화 동일한 효능과 최종 단계의 배아의 permeabilization을 가능하게하는 소설과 간단한 발견을 소개합니다. 또, 투과 표시와 같은 원적외선 염료 CY5 카르 복실 산의 사용은 포스트 픽스 애플리케이션?...

Drosophila의 배아 개발 2의 근본적인 메커니즘의 조사를 위해 최고의 모델이되고 있습니다. 이 강력한 모델은 임의의 시점에서 그리고 어떠한 현상 기관 내에 실질적으로 어떤 유전자의 조작을 허용하는 분자 유전 학적 도구의 다양한 배열에 의해지지된다. 초파리 배아의 형태 형성의 작은 크기, 빠른 개발, 다양한 특성은 기본적인 발달 경로에게 3,4를 발견했습니다 많은 것이 유전 스크린에 대한 선택의 모델을 확인합니다. Drosophila의 배아에 많은 표현형이 특징으로 쉽게 해석 할 수 있으며, 종종 비정상적인 특성에 대한 책임을 기본 분자 유전 학적 메커니즘을 식별 할 수있는 수단을 제공하고있다. 역사적으로, 플라이 배아 모델의 단점은 배아 조직에 작은 분자를 도입하는 어려움이있다. 1) 우리 :이 장애물에 대한 제한을 제기했다프로브가 발달 메커니즘을 심문하고 2) 특성화되지 않은 작은 분자의 기형 또는 약리학 적 활성을 평가하는이 설립 모델을 사용하기로 알려진 생리 활성 작은 ​​분자를 주입. 결과적으로, 비행 배아의 스크리닝 전위 저분자 활성의 특성화에 미달되었다. 달걀 껍질의 1) permeabilization 2) 미세 주입 : 플라이 배아에 작은 분자의 배달은 두 가지 방법으로 달성 될 수있다. 이 문서에서는 기존의 초파리 실험의 설정에서 실행하기 쉬운 permeabilization 방법에 대한 발전을 제시한다. 이는 마이크로 유체 기술 마이크로 인젝션 방식에서 최근의 진보는 또한 배아 5,6 화합물에 도입하는 방법에 기여하는 것을 주목해야한다. 배아에 분자를 소개하는 껍질 (7)의 밀랍 층에 의해 방지 할 수있다. 초파리의 알 껍질은 5 개의 층으로 구성되어 있습니다. 부터인사이드 아웃 그들은 : 난황 막, 밀랍 층, 내부 융모막 층, endochorion 및 exochorion 8. 세 가지 외부 융모 층은 희석 표백제에있는 태아의 간단한 출현에 의해 제거 될 수있다, 단계 dechorionation라고도합니다. 그것은 내부 난황 막 쌌다 유지하면서 노출 된 왁시 층은, dechorionated 배아 투과성 렌더링 헵탄 및 옥탄 7,9 같은 유기 용매에의 노출에 의해 손상 될 수있다. 그러나 이러한 용매의 사용은 독성과 태아의 생존 능력 9,10에 뚜렷한 부정적인 영향이 둘 다 자신의 강한 permeabilizing 조치를, 조절에 어려움으로 인한 합병증을 소개합니다. 용매 조성물 칭했다 배아 permeabilization (EPS)를 사용 permeabilization의 방법은 이전에 1을 설명 하였다. 이 용매 miscibl되는 용매를 사용 D-리모넨 및 식물 유래의 계면 활성제로 구성수성 버퍼와 전자. D-리모넨 원하는 농도로 용매를 희석 할 수있는 능력의 낮은 독성이 높은 생존력으로 투과 한 배아를 생성하는 효과적인 방법을 수득했다. 그러나,이 내인성 인자는 애플리케이션에 제한을 가지고 계속했다. 첫째, 배아 관리가 가까운 개발 준비를 유지하기 위해 취해야하는 경우에도, EPS 처리 후 투과성의 이질성을 보여줍니다. 둘째, 약 8 시간보다 오래된 계란 11 누워 후 발생하는 껍질의 경화와 일치, 투과하기 어려운 입증 된 배아. 여기에 설명 된 EPS 방법의 발전은 그 : 1) 고정 및 면역 염색 단계를 실행하고 2)&gt; (늦은 발달 시점에서 8 시간, 단계 배아의 permeabilization을 활성화 한 후에도 거의 동일 permeabilized 배아를 식별하고 분석하는 데 도움이 12 세 이상). 특히, 원적외선 염료의 응용 프로그램,CY5 카르 복실 산을, 개발하는 동안 포름 알데히드 고정 후 배아에서 계속 투과성 표시기 역할이 설명되어 있습니다. 또한, 18 ° C에서 배아를 양육하는 최종 단계의 배아 (단계 12 ~ 16)의 permeabilization을 가능하게 EPS 민감한 상태에서 껍질을 유지 것을 알 수있다. 이러한 진보는 EPS 방법론에 앞서 언급 한 한계를 극복. 이 응용 프로그램은 따라서 생존 능력을 유지하면서 별개의 발달 시점에서 배아의 관심 작은 분자를 소개 할 수있는 방법으로 조사를 제공 할 것입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fly Cage</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td style="width:119px;">59-101</td>
			<td style="width:204px;">http://flystuff.com/general.php</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cocamide DEA [Ninol 11-CM]&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Stepan Chemical</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.stepan.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7]&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Stepan Chemical</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.stepan.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">d-limonene (Ultra high purity grade)</td>
			<td style="width:201px;">Florida Chemical Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.floridachemical.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hypochlorite&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Fisher</td>
			<td>SS290-4</td>
			<td>http://www.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Fisher</td>
			<td>BP337</td>
			<td>http://www.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS powder</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>56064C</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>R6626</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CY5 carboxylic acid</td>
			<td style="width:201px;">Lumiprobe</td>
			<td>#23090</td>
			<td>http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>472310-100</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shields and Sang M3 medium</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>S8398</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitex Nylon mesh&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td>57-102</td>
			<td>http://flystuff.com/misc.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissolved oxygen (DO) membrane&#160;</td>
			<td style="width:201px;">YSI</td>
			<td>#5793</td>
			<td>http://www.ysireagents.com/search.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25mm circular no.1 cover slip&#160;</td>
			<td style="width:201px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48380-080</td>
			<td style="width:204px;">https://us.vwr.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grape-agar plate mix&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td>47-102</td>
			<td>http://flystuff.com/media.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nutator</td>
			<td style="width:201px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82007-202</td>
			<td style="width:204px;">https://us.vwr.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method of permeabilization of drosophila embryos for assays of small molecule activity

Drosophila의 배아는 긴 개발을 제어하는 분자 유전 메커니즘을 해명하기위한 강력한 실험실 모형이다. 이 모델의 유전 조작의 용이성은 다른 동물 모델 및 세포 기반 분석에서 평범 약물 접근 방식을 대신하게했다. 여기에 우리가 개발 초파리 배아에 작은 분자의 응용 프로그램을 사용할 수있는 프로토콜의 최근의 진보에 대해 설명합니다. 이 방법은 태아의 생존 능력을 유지하면서 껍질의 불 투과성을 극복하는 단계를 자세히 설명합니다. 발달 단계의 넓은 범위에 걸쳐 달걀 껍질 permeabilization 용매 이전에 설명 D-리모넨 배아 permeabilization (1 EPS)의 응용 프로그램과 (18 ° C) 이전 치료에 감소 된 온도에서 노화의 배아에 의해 달성된다. 또한, permeabilization 표시로 원적외선 염료 (CY5)의 사용은 표준 빨간색과 녹색 독감을 포함한 다운 스트림 응용 프로그램과 호환되는, 설명라이브 및 고정 준비에 orescent 염료. 이 프로토콜은 발달 메커니즘을 조사뿐만 아니라 특성화되지 않은 작은 분자의 기형 또는 약리학 적 활성을 평가하기위한 연구에하는 생리 활성 화합물을 사용하여 연구에 적용 할 수있다.

배아의 처리 장치는 위의 프로토콜에있는 조작에 대해 &quot;집에서 만든&quot;장치를 시각화 지원하기 위해 그림 1에 있습니다. 그림 2에 보이는 결과 개발 후반 단계에서 EPS로 permeabilized하는 능력에 18 ° C에서 배아를 양육의 강력한 효과를 보여줍니다. 이 조건은 프로토콜 2.1 단계에 적용된다. 일반적으로 EPS 처리 배아에서 볼 투과성의 다양한 수준을 나타 내기 위해 CY5 카...

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A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

개발 Drosophila의 배아에 작은 분자의 도입은 신규 화합물, 약물 및 독성 물질의 생물학적 활성의 특성뿐만 아니라 기본적인 발달 경로를 프로빙을위한 큰 잠재력을 제공합니다. 설명하는 방법은 여기에 초파리 배아 모델의 유틸리티를 확대,이 방법 자연 장벽을 극복 단계를 설명합니다.

의 Permeabilization의 방법<em&gt; 초파리</em작은 분자 활동의 분석 실험을위한&gt; 태아

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

a-method-permeabilization-drosophila-embryos-for-assays-small

Research

JoVE Journal

Biology

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

12.3K 조회수.  University of Rochester School of Dentistry and Medicine.  개발 Drosophila의 배아에 작은 분자의 도입은 신규 화합물, 약물 및 독성 물질의 생물학적 활성의 특성뿐만 아니라 기본적인 발달 경로를 프로빙을위한 큰 잠재력을 제공합니다. 설명하는 방법은 여기에 초파리 배아 모델의 유틸리티를 확대,이 방법 자연 장벽을 극복 단계를 설명합니다. 

비디오: A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Midgastrula 스테이지 Drosophila의 태아에서 문화의 연결 준비

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

연구

생물학

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

조기 칙 태아 예 생체내 (새로운 문화)의 문화에 대한 방법

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

의 간질 발작의 돌연변이에 대한 Neurocircuit의 Assays Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

의 전자 현미경을위한 배아의 준비 Drosophila 태아의 심장 관

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

Drosophila의 배아들 중에서 - 생체내의 원심 분리

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

의 입식 이미징 Drosophila 태아

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

대규모 Zebrafish 기반 생체내에서 작은 분자 화면

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Kinesin의 분리 및 정제에서 Drosophila 태아

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems. For most studies, functional assays are carried out using extracts that are prepared in bulk from 10-50 or more liters of cells grown in suspension. However, these large-scale preparations are not amenable to rapidly testing in vitro effects that result from a variety of in vivo cellular treatments or conditions. This journal video article shows a method for preparing functional small-scale nuclear extracts, using HeLa cells as an example. This method is carried out using as few as three 150 mm plates of cells grown as adherent monolayers. To illustrate the efficiency of the small-scale extracts, we show that they are as active as bulk nuclear extracts for coupled RNA Polymerase II transcription/splicing reactions. To demonstrate the utility of the extract protocol, we show that splicing is abolished in extracts prepared from HeLa cells treated with the splicing inhibitor drug E7107. The small-scale protocol should be generally applicable to any process or cell type that can be investigated in vitro using cellular extracts. These include patient cells that are only available in limited quantities or cells exposed to numerous agents such as drugs, DNA damaging agents, RNAi, or transfection, which require the use of small cell populations. In addition, small amounts of freshly grown cells are convenient and/or required for some applications.

A protocol for preparation of robust, small-scale HeLa nuclear extracts is described. This protocol is valuable for assays that require use of small populations of cells, such as cells treated with drugs or RNAi. The method should be applicable to a wide variety of gene expression assays and other cell types, including patient cells.

유전자 표현 기계의 기능 Assays을위한 소규모 핵 추출물

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...