이 프로토콜은 척수 재생의 분자 메커니즘에 대한 연구를 위해 축소로틀 척수 신경 줄기 세포에서 신속하고 관통하는 시간과 공간 제한 유전자 녹아웃을 허용합니다. 이 기술은 신경 줄기 세포에 있는 유전자 기능의 연구 결과, 발달 효과 또는 그밖 세포 모형에서 효력에 의해 혼동되지 않고 그것의 의학 재생을 허용합니다. Axolotl 신경 줄기 세포는 그들의 척수를 재생하는 그들의 기능에 크게 기여합니다.
재생 메커니즘을 이해하면 척수 손상에 대한 치료법을 개발하기 위한 통찰력으로 이어질 수 있습니다. 이 방법은 축축골 신경 줄기 세포가 척수 손상에 재생 반응을 어떻게 장착하는지에 대한 통찰력을 제공합니다. 척수 중앙 열에 주입 모세관을 올바르게 배치하는 것은 도전이 될 수 있으며 테스트 동물에서 연습하면 기술을 마스터하는 데 도움이됩니다.
관리를 보는 것은 주입을 수행하는 방법과 성공적인 주사가 어떻게 생겼는지 보여줄 수 있습니다. Cas9 가이드 RNA 리보핵 단백질 혼합물을 준비하려면 Cas9 핵 국소화 서열 단백질 5마이크로그램, 가이드 RNA 4마이크로그램, 10X Cas9 완충제의 0.9 마이크로리터를 혼합합니다. 그런 다음 핵이 없는 물로 총 부피를 10 마이크로리터로 가져와 Cas9 가이드 RNA 리보핵 단백질 혼합물을 영하 80도에 즉시 사용하지 않을 경우 저장한다.
아가로즈 전기포기 플레이트 준비를 위해 덜벡코의 PBS에서 2%의 아가로즈 200밀리리터를 준비하고 혼합물을 전자레인지에 녹입니다. 약간의 냉각 후, 액체 아가로즈를 10센티미터 페트리 접시에 약 10mm 깊이로 붓고 플레이트가 실온에서 고화되도록 합니다. 아가로즈가 단단할 때, 외과용 메스를 사용하여 꼬리를 똑바로 잡기 위해 각 접시의 아가로즈에 슬릿을 자르고, 동물의 몸에 잘 맞는 우물, 전극을 잡기 위해 2개의 여분의 우물을 사용하십시오.
그런 다음 접시를 얼음 위에 놓고 얼음차가운 DPBS로 림에 채웁니다. 전기포레이터를 구성하려면 5밀리초의 지속 시간, 50밀리초의 간격 및 전압 붕괴 없이 70볼트에서 포링 펄스를 하나의 양극성 펄스로 설정합니다. 전송 펄스를 40볼트의 4개의 양극성 펄스로 설정하여 50밀리초, 999밀리초 의 간격, 10%의 전압 감쇠를 설정합니다.
그런 다음 전극을 전극을 전기포레이터에 연결하고 핀셋을 조정하여 PBS의 비커에 전극을 잠수하기 전에 7밀리미터 떨어져 있습니다. 유리 마이크로 주입 모세 혈관을 준비하려면 제조업체의 지침에 따라 마이크로 피펫 풀러에서 램프 테스트를 수행하여 열 값을 결정합니다. 그런 다음 표시된 매개 변수로 테이퍼 된 끝으로 사출 모세 혈관을 당깁니다.
당기면 스테레오 현미경과 미세 한 집게를 사용하여 모세관을 각도로 부러 뜨리면 끝이 축소로틀 척추의 중앙 운하를 표적으로 할 만큼 얇은 위치에 기울어진 팁을 가지도록하면서 피부를 관통 할 만큼 강하게 유지하십시오. 팁을 로드하기 전에, 1- 30 비율로 리보핵 단백질 혼합물에 빠른 녹색 FCF 용액을 추가하고 젤 로딩 파이펫 팁을 사용하여 주입 혼합물의 약 5 마이크로리터를 모세관에 적재한다. 그런 다음 경사진 팁이 아래쪽으로 향하는 공압 펌프에 모세관을 장착합니다.
공압 펌프를 구성하려면 홀드를 평방 인치당 0.5 파운드로 설정하고, 배출은 평방 인치 홀드당 2 파운드로, 게이트 기간은 됩니다. 모세관과 펌프 설정을 테스트하려면 모세관을 물 한 방울에 담그고 발 페달을 눌러 주입하십시오. 사출 믹스는 느리지만 꾸준한 스트림에서 나와야한다.
리보핵 단백질 혼합물을 주입하려면, 진정을 확인하기 위해 물에 거꾸로 주입되는 축축토를 뒤집어 링 집게를 사용하여 동물의 왼쪽과 꼬리가 오른쪽을 가리키는 실리콘 침대에 한 동물을 이송한다. 스테레오 현미경의 시야 의 중간에 주입 부위를 배치하고 모세관이 시야의 오른쪽에서 60도 각도로 동물로 들어갈 수 있도록 미세 조작기조절기조정. 척수와 중앙 운하를 확인한 후 모세관을 척수의 중앙 운하쪽으로 천천히 움직여 피부와 근육을 부드럽게 관통합니다.
모세관이 제자리에 있을 때, 발 페달을 누르고 중앙 운하에 혼합물을 주입합니다. 모세관이 제대로 배치되면, 리보핵 단백질 혼합물은 중앙 운하를 따라 양방향으로 청색선으로 퍼질 것이다. 모세관을 올바르게 배치하는 것은 어려울 수 있습니다.
혼합물이 올바르게 퍼지지 않으면 풋패드를 누르면서 작은 단계로 모세관 위치를 조정합니다. 혼합물이 척수의 끝에 있는 말단 소포와 두뇌에 있는 심실에 도달할 때까지 발 페달을 계속 누르십시오. 주사 중에 배출 압력을 조정해야 할 수도 있습니다.
주입 직후, 링 포셉을 사용하여 동물을 얼음 위에 준비된 아가로즈 전기기판으로 옮기고 슬릿 내부에 꼬리를 놓아 아가로즈에 의해 끼어들게 한다. 전극을 꼬리 양쪽의 우물에 넣고 전체 동물과 전극이 얼음차가운 PBS로 덮여 있음을 주의하고 발 스위치를 눌러 전기포공을 시작합니다. 그런 다음 동물을 완전한 회복이 될 때까지 모니터링하여 물로 돌려보내서 후속 동물을 동일한 방식으로 주입하고 전기포전시합니다.
단백질 수준에서 녹아웃의 효율을 평가하기 위해, 꼬리의 단면을 얻고 표준 프로토콜에 따라 면역 히스토케미컬 분석을 수행한다. 대안적으로, 전기화 척수를 추출하고 DNA를 얻기 위해 샘플을 lyse. 그런 다음 유전자 질식 PCR을 수행한 다음 Sanger 시퀀싱 또는 차세대 시퀀싱을 수행하여 편집된 유전 적 loci의 비율을 평가합니다.
Sox2에 대한 Cas9 가이드 RNA 복합체의 주사 및 전기포기는 척수 신경줄기 세포의 대다수에서 Sox2 면역 반응활성의 대규모 손실로 이어지며, 대조군으로서 티로시나제에 대한 Cas9 가이드 RNA 복합체의 주사 및 전기화를 비교하였다. 척수 조직 단면 샘플에서 Sox2 양성 세포의 정량화는 Cas9 Sox2 가이드 RNA 전기화 녹아웃 동물에서 Sox2 발현 세포의 현저하게 감소 된 수를 밝혀, 이 방법은 척수 신경 줄기 세포에서 효율적이고 높은 관통 유전자 녹아웃으로 이어질 것을 나타내는. Sox2 및 GFP에 대한 두 개의 Cas9 가이드 RNA 복합체의 동시 주사 및 전기 포기 후 유비쿼터스 GFP 발현을 가진 형질성 축소로오스로, 이중 녹아웃 신경 줄기 세포의 높은 비율이 관찰되어 프로토콜이 여러 유전자를 유연하게 노크하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다.
모세관으로 중앙 운하를 대상으로 하는 연습을 하고 주사가 예상대로 작동하지 않을 때에 대한 문제 해결 단계를 사용하여 수식을 착용하는 것이 도움이됩니다. 이 기술은 연구원이 재생에 특정신경 줄기 세포에 있는 유전자의 기능을 공부하는 것을 허용합니다. 모세관을 조작 할 때주의하고 자신의 손가락을 찌르지 않도록하십시오.
