맹인 멕시코 동굴 물고기라고도 불리는 Astyanax 멕시코는 특히 적응성 유전 적 특성의 진화를 이해하는 생물 과학 분야의 다양한 연구 분야의 모델 유기체로 부상하고 있습니다. 이 종은 강가의 표면 모프와 동굴 주거 모프로 구성되어 있어 시간이 지남에 따라 같은 종의 두 인구가 어떻게 갈라진지 분석할 수 있습니다. 그러나, 이 연구가 일어날 수 있기 위하여 우리는 건강한 시간 일치한 태아 및 하이브리드 단배를 얻을 수 있어야 합니다.
이 종은 실험실에서 쉽게 유지 및 사육하는 동안 물고기는 주로 낮 동안 갓 배치 된 배아를 얻기 위해 도전하게하는 밤 시간 동안 산란. 이 프로토콜에서 우리는 Astyanax 멕시코를 변경 된 광 주기 및 온도 변화에 적응시킴으로써 사육 주기를 하루 중 보다 편리한 시간으로 전환 할 수있는 방법을 보여줍니다. 다음으로, 우리는 적당한 부모 물고기를 식별하고 마취 한 남성과 여성에서 게임테를 수집하는 방법을 보여줍니다.
마지막으로, 우리는 체외 수정을 사용하여 실행 가능한 자손을 생산하는 방법을 설명하고 성공적인 수정의 징후를 논의합니다. 우리는 유전 구조물의 주입 및 발달 분석과 같은 절차가 일반적인 근무 시간 도중 쉽게 실행될 수 있는 이 프로토콜을 가능하게 하는 이 프로토콜을 기대합니다. 또한이 기술은 모든 동굴과 표면 거주 인구 사이의 하이브리드 크로스를 만드는 데 유용 할 수 있습니다.
여러 줄의 탱크가 들어있는 불투명하고 완전히 밀폐된 유동 양식 시스템 내에 어항을 설정합니다. 프라이밍 공정 중 온도를 수동으로 변경하는 데 사용되는 독립적인 발열체로 각 탱크의 온도를 유지합니다. 각각의 별도의 포토기간을 사용하도록 설정합니다.
빛이 들어오거나 탈출하는 것을 방지하기 위해 닫을 수 있는 각 행에 문을 설치합니다. 자동 컨트롤러는 물고기에 대한 방해가 가장 적은 모든 광도 기간을 조작할 수 있습니다. 랙에 빨간색 작업표시등 및 정전 커튼을 장착하여 어두운 시간대에 출입할 수 있습니다.
일반 시스템 랙에서 원하는 물고기를 제거하고 프라이밍 14 일 전에 포토 기간의 조정을 허용하기 위해 사육 랙에 배치합니다. 이를 통해 물고기가 새로운 환경에 적응할 수 있습니다. 설치된 수중 난방 시스템을 사용하여이 기간 동안 22.8도에서 물고기를 유지합니다.
일반 포토기간은 6a.m~ 8p.m 라이트, 8p.m이다.
오전 6시.m. 라이트 사이클 랙의 경우 광기간을 10p.m.m.m.
12 p.m. ~ 10 p.m. 랙 내의 빛을 강화하는 타이머를 조정하여 어둡게.
물고기가 적응되면 산란을 위해 동물을 프라이밍하기 시작합니다. 총 6일이 걸리는 절차입니다. 이 시간 동안 설치된 수중 난방 시스템을 사용하여 오바 생산을 프라임온도를 변경합니다.
첫날기온은 섭씨 22.8도에서 섭씨 24.4도로 올라갑니다. 둘째 날기온은 섭씨 24.4도에서 섭씨 26.1도로 올라갑니다. 셋째 날과 4일은 섭씨 26.1도까지 유지합니다.
물고기는 낮에 생성 할 준비가될 것이며 IVF는 수행 할 수 있습니다. 5일째기온은 섭씨 26.1도에서 섭씨 24.4도로 낮습니다. 6일째기온은 섭씨 24.4도에서 섭씨 22.8도로 낮춘다.
이 온도 주기를 반복하기 전에 7일 간격을 제공합니다. 이 이동 된 빛 주기에 적응 하기 위해 물고기에 의해 필요한 전반적인 시간을 줄일 것 이다 때문에이 포토 기간에 물고기를 유지 하는 것이 좋습니다. 먼저 축축한 티슈 닦이를 페트리 접시 뚜껑에 삽입하고 접시를 닫아 가습 챔버를 만들고 모음 과정에서 오바가 건조되는 것을 방지합니다.
다음으로 컬렉션용 여성을 선택합니다. 큰 돌출 복부를 가진 중력 물고기는 가능성이이 절차에 대한 최선의 선택이 될 것입니다. 차가운 물을 사용하여 여성을 고정하고 촉촉한 스폰지 동물 홀더에 척추 위치에 그녀를 배치합니다.
일단 물과접촉하면 섬세한 티슈 와이프로 물고기의 복부 면이 활성화되면 ova가 활성화됩니다. 엄지손가락과 검지 손가락 사이에 여성을 잡습니다. 손가락을 살짝 굴리면서 비뇨 생식기 개구 방향으로 코일로믹 캐비티의 측면을 부드럽게 짜냅니다.
일회용 주걱을 사용하여 표현 된 오바를 수집합니다. 이 것들을 가습한 페트리 요리로 옮기세요. 특정 부모 데이터가 필요하지 않은 경우 여러 개의 ova 클러치가 동일한 접시에 결합될 수 있습니다.
수집 후 부드럽게 시스템 물로 채워진 복구 탱크에 물고기를 반환합니다. 컬렉션에 대한 남성을 선택합니다. 남성 게임화 품질의 겉으로 보이는 징후는 없습니다.
그러나, 물고기는이 절차에 사용 하기 전에 외관에 건강 한 표시 해야 합니다. 차가운 물을 사용하여 남성을 고정하고 촉촉한 스폰지 동물 홀더에 척추 위치에 배치합니다. 물과접촉하면 물고기의 복부 면을 섬세한 티슈티 와이프로 블롯하여 밀트가 활성화됩니다.
비뇨 생식기 개구부에 모세관 튜브의 끝을 부드럽게 놓습니다. 엄지와 집게 손가락으로 물고기의 측면에 부드러운 압력을 가하여 밀트를 추방하십시오. 비뇨 생식기 개구부를 향해 이동하는 아가미에 태스벗을 시작합니다.
모세관 튜브 의 끝에 있는 밀트를 수집합니다. 흡착기 튜브를 사용하여 부드러운 흡입이 필요할 수 있습니다. 밀트로 추방 될 수있는 대변을 피하십시오.
빈 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에 milt를 분배하고 정자 익스텐더 E400의 두 배로 희석합니다. 얼음을 유지합니다. 특정 부모 데이터가 필요하지 않은 경우 여러 남성의 밀트가 함께 풀로 풀어질 수 있습니다.
이 단계는 몇 시간 동안 milt의 근무 시간을 연장하는 데 사용할 수 있지만 즉각적인 수정에는 필요하지 않습니다. 수집 후 부드럽게 시스템 물로 채워진 복구 탱크에 물고기를 반환합니다. 각 주식에 대한 새로운 파이펫을 사용하여 정자와 milt로 수정하기 전에 튜브의 측면을 피킹 및 / 또는 교반하여 정자를 혼합하고 시간이 지남에 따라 E400 솔루션에 정착합니다.
새로 수집된 오바에 milt 또는 확장 된 milt 용액을 분배합니다. 빠르게 클러치에 시스템 물 1 밀리리터를 추가하여 정자와 계란을 활성화하여 수정을 위해 활성화합니다. 접시 내용물의 혼합 또는 교반을 피하고 2분간 수정이 발생하도록 하십시오.
E2 배아 미디어를 추가하여 접시 를 2/3 가득 채웁니다. 후속 절차에 따라 배아는 다운스트림 응용 프로그램에 즉시 사용하거나 5일 후 수정에 도달할 때까지 23도의 섭씨 23도에서 E2 배아 미디어에서 배양될 수 있습니다. 이 시점에서 우리는 시스템 물을 사용하여 주요 재순환 하우징 시스템으로 배아를 전송합니다.
이 방법의 주요 강점은 아스티아나엑스 멕시코인의 동굴 및 표면 하이브리드의 신뢰할 수있는 생산이다. 하이브리드 생산의 전통적인 방법은 이러한 물고기의 변경 산란 시간을 초래 하는 Astyanax 멕시코의 동굴 형태에 circadian 리듬의 손실로 인해 매우 도전. Astyanax 멕시코에서 성공적인 IVF 절차를 위해 수집 된 ova의 품질은 매우 중요합니다.
큰 돌출 복부를 가진 Gravid 암컷 물고기는 외관에서 명확하고 조차 나타나는 실행 가능한 ova를 풀어 놓일 가능성이 높습니다. 이러한 ova에 수집 된 milt를 추가하면 일반적으로 20 ~ 30 분 이내에 수정 된 배아의 발달이 발생합니다. 실행 가능한 태아는 발달 주기의 1개의 세포 단계를 입력하기 전에 약간 더 반투명하게 될 것입니다.
수정되지 않은 ova는 더 고르지 않고 불투명하게 나타납니다. IVF를 사용하여 테나야 동굴어와 표면 물고기의 하이브리드를 생성하면 광범위한 형태학적 표현형을 검사할 수 있습니다. 예를 들어, 표면/동굴 하이브리드는 눈의 존재를 나타내는 눈을 가지고 지배적 인 특성이다.
그러나 표면 동굴 F2 하이브리드에서는 Astyanax 멕시코인의 눈 크기를 제어하는 여러 로시가 있어 정량적 특성이 된다는 것을 나타내는 광범위한 눈 크기를 얻습니다. 또 다른 예는 색소 침착입니다. 표면과 동굴물고기의 F1 하이브리드를 관찰, 그것은 물고기가 완전히 색소로 신체 색소가 지배적 인 특성임을 결론을 내릴 수있다.
F2 세대에서 신체 색소침착의 변화는 다시 정량적 특성을 가리킵니다. 시퀀싱 데이터와 이 표현성 데이터의 조합은 이러한 표현형에 대한 기본 유전 적 궤적을 드러낼 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 아스티아나엑스 멕시코인의 번식 주기를 하루 중 보다 편리한 시간으로 옮기고 체외 수정을 사용하여 건강한 가능한 배아를 얻는 방법을 배웠습니다.
초기 단계 배아와 작업을 허용 하는 것 외에도 그것은 또한 정자 냉동 보존의 미래 탐사를 수 있습니다. 이 기술의 표준화는 초기 발달 및 유전 연구를 위한 모형 시스템으로 Astyanax 멕시코를 강화합니다.
