없음입니다.

이 연구는 IRCCS Ca에서 제도적 검토 보드에 의해 승인 되었다 ' Granda 재단, 폴 병원, 밀라노, 이탈리아.
1입니다. 다양 한 환자와 조직 표본
<ol><li>모든 제공 되며 고 오신 (H & E) 및 원래 진단에서 IHC 슬라이드 포함 하 여 분석, 모든 경우의 보관 슬라이드를 검색 하 고, 있으면, 하나의 H & E의 일치 비 종양 약 유 방 조직 (예를 들어, 수술 여백) .</li>
	<li>
케이스 검토를 수행 합니다. 참고:이 작업에 대 한 유 방 병 리에 경험을 가진 적어도 2 명의 병리학 진단 슬라이드 토론 고 해야 collegially 불일치를 해결 합니다. 사용 하 여 기존의 현미경 또는 telepathology 도구 (선호 multicentric 연구에서 후자). 경우, 모든 귀에 거슬리는 경우를 제외 합니다.<ol>
<li>18유 방 종양의 세계 보건 기구 (WHO) 분류의 최신 버전에 따라 모든 경우의 조직학 재분류를 수행 합니다.</li>
		<li>그 각각의 경우에 정상적인 조직을 보관 임상 샘플에 존재 하는 경우 구성 하나 이상의 종양 약 비 터미널 ductal lobular 단위를 확인 하십시오.</li>
		<li>표시 유형이 다른 모든 종양 약 영역 식별 cytological, 건축, 또는 IHC 기능 (공동으로 수행 하는 병리학 자 고 누구는 TMAs를 건설할 것 이다 technician(s)) 밝은 분야 현미경을 사용 하 여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>유리 슬라이드에 표시와 함께 또는 디지털 슬라이드 소프트웨어 (그림 1A)에 적절 한 도구와 개별 지형 영역을 강조 표시 합니다.</li>
	<li>선택한 슬라이드에 따라 달라 집니다, 보관 함에서 해당 FFPE 블록을 검색 합니다. 참고: TMA를 최적화 하기 위해 건설, 조직 소모를 방지 하 고 보존 TMA 펀치 구조적 무결성, 경우 < 1 mm 두께 잔여 조직을 제외 해야 합니다.</li>
</ol>2. 설계 및 TMAs Kononen 기술에 기반을 구축합니다
<ol><li>
만들기 각 케이스의 고유 영역의 레코드를 통합 새 스프레드시트 파일을 엽니다. 표 1에 exemplified 별도 열에 다음 데이터를 포함: 사례 ID, 블록 ID, 지역 ID, 조직 유형 (예, 정상 조직, 침략 적 구성 요소 histotype, 제자리에서 구성 요소 histotype), 지형 (예를 들면, 종양 코어, 침략 앞), 형태 (예를 들면, 핵 학년, 건축, mitoses, cytological 기능), 생체 상태 (즉, 에스트로겐 수용 체 (ER), 황 체 호르몬 수용 체 (홍보), Ki67, 그리고 HER2), 그리고 사용할 수 있는 모든 다른 IHC 기능.<ol>
<li>문서를 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
TMA 프로젝트를 만듭니다.
	<ol>
<li>설치 하 고 TMA 디자이너 소프트웨어를 엽니다.</li>
		<li>TMA 받는 블럭과 정의: 파일 메뉴를 통해 액세스 > 새로 만들기 > 블록 또는 CTRL + B를 사용 하 여</li>
		<li>첫 번째 필드 채우기 또는 Tab 키를 누르고 파라핀 블록의 치수 입력를 클릭: 폭 35 (mm), 높이 20 (mm). "여백" 값 (즉, 파라핀 지 m m에서에서 거리)으로 "2" 형 (그림 1B). 적절 한 버튼을 클릭 하 여 데이터를 저장 합니다. 받는 사람 블록의 새 서식 파일 지금 저장 고 새로운 조직 배열 서식 파일에서 사용할 준비가.</li>
		<li>조직 배열 프로젝트 만들기: 파일 메뉴에 액세스 > 새로운 > 조직 배열 또는 CTRL + t.를 사용 하 여</li>
		<li>조직 배열, 의견, 및 저자, 이름 입력 후 다음 클릭 합니다 "." "가져오기" 아이콘을 클릭 합니다 받는 사람 블록 이전에 만든 서식 파일을 선택 하 고 클릭 합니다 "."</li>
		<li>라운드 단추를 클릭 하 여 자리 크기 1 mm를 선택 합니다. 인근 관광 명소의 2 개의 센터 사이 공간이 자리 간격으로 500 µ m를 선택 합니다. 231 되어야 계산기 아이콘 생성, 관광 명소의 총 수를 계산을 클릭 합니다. 클릭 "다음."</li>
		<li>그것을 한 번 클릭 하 여 자리 번호 모드를 정의 합니다. 버튼을 클릭 "정의" 격자 및 하위 표를 만들려고 합니다. 중앙 선 (6 선) 삭제와 8과 15 열. 방향에 대 한 1 번 줄의 3 명소를 유지 합니다. 그림 2에 표시 최종 지도 183 명소의 총 수를 포괄 한다.</li>
		<li>조직 유형 목록 정의: 파일 메뉴를 통해 액세스 > 새로운 > 조직 유형 또는 CTRL + l.를 사용 하 여 목록</li>
		<li>이전에 정의 된 조직 설명을 삽입 합니다. 아래쪽 화살표를 누르거나 클릭 합니다 + 선 추가 버튼을.</li>
		<li>프로젝트 정의: 파일 메뉴를 통해 액세스 > 새로 만들기 > 부스터 프로젝트 또는 CTRL + p.를 사용 하 여</li>
		<li>조직 배열, 의견, 및 저자, 이름 입력 후 다음 클릭 합니다 "." 스프레드시트 파일, 조직 형식의 목록 및 이전에 적절 한 아이콘을 클릭 하 여 만든 조직 배열 모델을 가져옵니다.</li>
		<li>"모두 선택"을 클릭 하 고 각 조직 유형;에 대 한 관광 명소의 수 정의 설정을 적용 하려면 "검색" 버튼 클릭 합니다. 샘플링 되 고이 프로젝트에 있는 받는 사람 블록 전송 되는 코어의 총 수를 나열 하는 테이블에 표시 됩니다. 프로젝트를 저장 하 고 프로그램을 닫습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수락자 블럭과 (그림 1B)를 준비 합니다.
	<ol>
<li>65 ° c.에 elasticized 파라핀 정화 금속 금형 채우기</li>
		<li>금속 금형 내부 하룻밤 실 온에서 냉각 파라핀 블록을 둡니다.</li>
		<li>금속 금형에서 파라핀 블록을 추출 합니다. 균열 발생, 블록을 취소 하 고 단계 2.3.1-2.3.3를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
TMA는 자동 또는 반자동 arrayer19를 사용 하 여 구성 합니다.
	<ol>
<li>선택한 모든 FFPE 블록과 주석으로 해당 H & E 섹션을 검색 합니다.</li>
		<li>켜고는 arrayer arrayer 회전 목마에 수락자 블럭과 삽입.</li>
		<li>Arrayer 제어 역 소프트웨어를 열고, "새로운 조직 배열"에 클릭 하 고 이전에 만든 프로젝트 (그림 1C)를 로드.</li>
		<li>"계속"을 클릭 하 고 메뉴에서 기증자 블럭과의 위치를 선택 합니다.</li>
		<li>각 받는 사람 블록에 시작 하는 위치 정의: 화살표 키를 사용 하 여 레이저 빛을 이동 하 고 받는 사람 블록의 파라핀에 왼쪽 가장자리 정렬.</li>
		<li>"다음"을 클릭 하 고 세로 맞춤에 대 한 반복 합니다.</li>
		<li>"다음" 자동으로 받는 (수락자) 블록의 이전에 정의 된 좌표에 구멍을 만들기를 클릭 합니다.</li>
		<li>빈 펀치.</li>
		<li>샘플링에 대 한 기증자 블록 놓고 관심의 이전 주석된 영역에서 조직 핵심을 제거 합니다.</li>
		<li>받는 사람 (수락자) 블록에 구멍에 기증자 조직 코어를 삽입 합니다.</li>
		<li>arrayer에서 기증자 블록을 제거 합니다.</li>
		<li>TMA를 완료 될 때까지 2.4.5-2.4.11 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>살 균 빈 슬라이드에 새로 생성 된 TMA 블록의 조직 쪽을 넣고 5 분 동안 45 ° C에서 실험실 오븐에 넣어.</li>
	<li>부드럽게 5 슬라이드에 블록을 누르십시오 s 조직 코어를 평평 하 게. 총 2 회) (한 번 반복 합니다.</li>
	<li>오븐에서 슬라이드와 TMA 블록을 제거 하 고 뒤집고, 부드럽게 슬라이드에서 블록을 분리.</li>
	<li>65 ° c.에 elasticized 파라핀의 얇은 층으로 TMA 조직 표면</li>
	<li>TMA 블록을 2 h에 대 한 실 온에 둡니다.</li>
	<li>24 h 4 ° C에서 TMA 블록을 전송 합니다. 참고: TMA 블록 저장할 수 있습니다 4 ° C에 피로까지.</li>
</ol>3. 조직화 학적인 및 Immunohistochemical 분석
<ol><li>
TMA 섹션을 잘라.
	<ol>
<li>파라핀 진정 10 분-10 ° C 표면에 파라핀 사이드와 TMA 수락자 블럭과 내려 놓습니다.</li>
		<li>초순에 채워 부양 목욕 고 열 38 ° c.에 설정</li>
		<li>새로운 블레이드를 회전 톰에 놓고 왁 스 블록 블레이드 얼굴과 수직 평면에 정렬 있도록 톰 척에 블록을 삽입 합니다.</li>
		<li>블레이드와 블록을 신중 하 게 접근 하 고 되도록 위치 정확한; 몇 얇은 섹션을 잘라 필요한 경우 조정 합니다.</li>
		<li>3 µ m 두께 섹션을 잘라.</li>
		<li>핀셋을 사용 하 여 섹션을 선택 하 고 목욕 물 표면에 떠.</li>
		<li>일반 및 IHC/분 유리 슬라이드에 물 탕 밖으로 섹션을 선택 하십시오.</li>
		<li>슬라이드를 선반에 놓고 하룻밤 45 ° c 오븐에서 그들을 저장 합니다. 참고: 일단 준비, TMA 섹션 24 시간 이내 스테인드 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
조직화 학적인 얼룩 (H & E) 수행 된 autostainer를 사용 하 여.
	<ol>
<li>Autostainer 선반에 슬라이드를 삽입 하 고 10 분 동안 60 ° C에 그들을 배치.</li>
		<li>Autostainer와 TMA와 선반 바깥쪽에 직면 하는 표준 H & E 클립으로 로드 스테이션 중 하나에 슬라이드 삽입의 부하 서랍을 엽니다.</li>
		<li>일단 서랍, 시스템에서 자동으로 클립을 인식 닫히고 다음 프로토콜 시작 됩니다: 오븐 역에서 37 ° C (6 분), 크 실 렌 (2 분), 크 실 렌 (2 분), 에탄올 100% (2 분), 에탄올 100% (2 분), 에탄올 95% (2 분), 에탄올 95% (2 분) 증 류 물 (4 분), Carazzi의 되며 (9 분), 저압 흐르는 물 (2 분), 오신 1% (1 분), 저압 흐르는 물 (2 분), 에탄올 95% (20 s), 에탄올 95% (20 s), 에탄올 95% (20 s), 에탄올 95% (20 s), 에탄올 100% (15 s), 에탄올 100% (15 s) 크 실 렌 (30 s), 크 실 렌 (30 s).</li>
		<li>서랍에서 선반을 언로 드 하 고 탑재와 커버 슬립 슬라이드.<ol>
<li>마운트는 피 펫의 한 방울을 수집 하 고 커버 슬라이드의 외부 가장자리에 그것을 넣어.</li>
			<li>슬라이드에 커버 슬립의 젖은 측면을 놓고 산 30 분 동안 건조 하자.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
IHC ER, PR, Ki67, HER2 얼룩 수행 자동화 된 immunostainer를 사용 하 여. 참고: 얼룩 실행을 시작 하기 전에 시스템, 시작 및 확인 소모품 시 약 병 (자료 테이블) 하 고 컨테이너를 낭비.<ol>
<li>10 분 동안 60 ° C에서 분석 TMA 슬라이드를 놓습니다.</li>
		<li>Immunostainer 계측기 및 소프트웨어를 시작 합니다.</li>
		<li>홈 보기에서 프로토콜 클릭 한 다음 만들기/편집 프로토콜을 클릭 합니다.</li>
		<li>표준 한 덩어리를 선택 (3, 3'-diaminobenzidine) 기본 서식 파일을 수정 하려면 IHC 절차.</li>
		<li>상자 목록에서 "Deparaffinization" 플래그와 매체 온도 72 ° c.에 설정</li>
		<li>Cc1 unmasking 솔루션 플래그, 95 ° C, 및 36 분 보육 시간에 매체 온도 설정 합니다.</li>
		<li>1 차적인 항 체 상자 플래그, 응급실 인라인 디스펜서 (악기 소프트웨어 시 약 회전 목마에 디스펜서를 인식할 것 이다)의 ID를 삽입 하 고 부 화 시간 16 분 설정.</li>
		<li>플래그 Counterstaining 상자, 선택 되며, 그리고 설정 부 화 시간 12 분.</li>
		<li>"다른 이름으로 저장" 버튼을 클릭 하 고 프로토콜 이름을.</li>
		<li>다음과 같은 1 차적인 항 체 외피 시간을 사용 하 여 나머지 항 체에 대 한 단계 3.3.3-3.3.9 반복: 홍보 16 분, Ki67 16 분, HER2 12 분 사용 중 희석된 준비--사용 (RTU) 항 체.</li>
		<li>홈 보기에서 레이블 만들기 버튼을 클릭 합니다.</li>
		<li>프로토콜 단추를 클릭 하 고 분석 하는 TMA의 각 ER, PR, Ki67, 그리고 HER2 프로토콜 추가.</li>
		<li>/Print 닫기 버튼을 클릭 합니다.</li>
		<li>레이블 서식 파일 나타납니다 레이블에 대 한 TMA Id를 입력 합니다.</li>
		<li>인쇄 버튼 레이블을 인쇄 하 고 다음 TMA 슬라이드에 적용을 클릭 합니다.</li>
		<li>악기 아이콘을 클릭 하 고 "준비"로 악기 시작 모드를 설정 합니다.</li>
		<li>시 약 회전 목마를 포함 하는 후드, 검출 시스템, 열고 1 차 항 체는 다음 후드를 닫습니다.</li>
		<li>로드 하 여 열, TMA 슬라이드 서랍 같은 버튼을 클릭 하 여 닫고 슬라이드 서랍에 전면 버튼을 클릭 합니다.</li>
		<li>악기 시작 모드를 "실행"으로 설정 하 고 지침을 따릅니다.</li>
		<li>TMA 악기 슬라이드 제어에 완료 슬라이드 단추와 린스 개방 모든 서랍을 누르면 슬라이드 실행된, 언로드의 끝에 그들에 따뜻한 비눗물 모든 나머지 시 약을 제거 하.</li>
		<li>저압 차가운 실행 물 아래 슬라이드를 세척, TMA 슬라이드를 탈수 하 고 유리 coverslip 각 슬라이드에 적용.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ER, PR, HER2 IHC 분석 수행는 미국 협회의 임상 종양학 (ASCO) 다음 지침, 모자 /와 Ki67 유방암 워킹 그룹 (표 2)에서 국제 Ki67의 권고에 따라. 참고:이 분석 수행 되어야 합니다 별도로 개별 조직 관광 명소에서 유 방 병리학에서 경험 병리학 자에 의해.<ol>
<li>종양 세포 핵의 ≥ 1% immunoreactive20,21,,2223있다면 긍정적으로 응급실 식을 평가 합니다.</li>
		<li>종양 세포 핵의 ≥ 1% immunoreactive20,21,,2223있다면 긍정적으로 홍보 식을 평가 합니다.</li>
		<li>HER2 식을로 평가: a) 점수 3 + 원주 막 얼룩을 완전 하 고 강렬한, b) 점수 2 + 원주 막 얼룩은 불완전 한 약한/온건 하 고 침략 적인 종양 세포의 또는 완전 한 > 10% 이내 및 원주 막 얼룩은 강렬 하 고 침략 적인 종양 세포, c ≤ 10% 이내) 점수 1 + 불완전 막 얼룩이 희미 한/거의 지각할 수 있는 고 침략 적인 종양 세포, d의 > 10% 이내) 부정적인 얼룩이 지는 존재 하는 경우 또는 막 얼룩은 불완전 하 고 희미 한/거의 지각할 수 있는 그리고 ≤ 내 침략 적인 종양의 103,24세포.</li>
		<li>임의로 적어도 1000 종양 약 세포에서 핵 얼룩과 셀의 비율 선택 10 고 전력 분야 (확대, 400 X) Ki67 인덱스 평가25.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. SISH HER2 분석
<ol><li>TMA 섹션 (반복 단계 3.1)을 잘라.</li>
	<li>
HER2 위한 SISH는 자동된 immunostainer를 사용 하 여 수행 합니다.
	<ol>
<li>10 분 동안 60 ° C에서 분석 TMA 슬라이드를 놓습니다.</li>
		<li>Immunostainer 계측기 및 소프트웨어를 시작 합니다.</li>
		<li>홈 보기에서 프로토콜 클릭 한 다음 만들기/편집 프로토콜을 클릭 합니다.</li>
		<li>기본 서식 파일을 수정 하려면 "U 듀얼 틱 CKT" 절차를 선택 합니다.</li>
		<li>"건조" 상자 목록에서 플래그 하 고 20 분 동안 63 ° C에 온도 설정 합니다.</li>
		<li>플래그 상자 목록, 다음 "셀 컨디셔닝 CC2", "셀"을 조절 하 고 4 분에 86 ° C 및 부 화 시 온도 설정 합니다.</li>
		<li>플래그 CC2 가벼운 (주기 1), 표준 (2 주기), 및 확장 (주기 3) 8 분, 12 분, 8 분, 각각.</li>
		<li>상자 목록에서 "틱-효소 3" 플래그를 16 분 보육 시간을 설정.</li>
		<li>HER2DNP 및 CHR17DIG 프로브를 선택 하 고 6 h에 보육 시간을 설정.</li>
		<li>8 분 동안 76 ° C에 세척을 설정 합니다.</li>
		<li>32 분 SISH multimer (SIL 틱 DNP HRP) 부 화 시간을 설정 합니다.</li>
		<li>4 분은 chromogen (SIL 틱 DNP CHRC) 부 화 시간을 설정 합니다.</li>
		<li>24 분 빨간 multimer (빨간 분 발굴 AP) 부 화 시간을 설정 합니다.</li>
		<li>8 분에 빨간 chromogen (빨간 분 발굴 FR) 부 화 시간을 설정 합니다.</li>
		<li>상자 목록에서 플래그 "Counterstaining" "되며 II"를 선택 하 고 8 분 보육 시간을 설정.</li>
		<li>상자 목록에 "-Counterstaining" 플래그 "청소법 시 약"을 선택 하 고 4 분에 보육 시간을 설정.</li>
		<li>3.3.11-3.3.15에서 단계를 반복 (선택 수정 U 듀얼 틱 CKT 프로토콜).</li>
		<li>오픈 후드 시 약 회전 목마를 포함 하는 세척 및 분 검출 시스템 다음 후드를 닫습니다.</li>
		<li>3.3.18-3.3.21에서 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>HER2SISH 분석 수행: HER2/CEP17이 경우 ≥2.0은 평균 HER2 복사 번호 ≥4.0 신호 셀 당 HER2 유전자 증폭으로 긍정적인 평가 및 부정적인 HER2/CEP17이 경우 < 2.0 HER2 평균 복사 번호 < 4.0 신호/셀3,24. 참고: IHC와 마찬가지로,이 분석에서에서 수행 되어야 합니다 별도로 개별 조직 명소 경험 유 방 병리학에서과 병리학 자에 의해.</li>
</ol>

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+in+situ+hybridization+in+breast+cancer:+clinical+implications+of+polysomy+17+and+genetic+heterogeneity.">HER2 in situ hybridization in breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and genetic heterogeneity.</a> Mod Pathol. 27 (1), 4-18 (2014).</li><li>Sanguedolce, F., Bufo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+assessment+by+silver+in+situ+hybridization:+where+are+we+now?.">HER2 assessment by silver in situ hybridization: where are we now?.</a> Expert Rev Mol Diagn. 15 (3), 385-398 (2015).</li><li>Fusco, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Contrasting+Role+of+p16Ink4A+Patterns+of+Expression+in+Neuroendocrine+and+Non-Neuroendocrine+Lung+Tumors:+A+Comprehensive+Analysis+with+Clinicopathologic+and+Molecular+Correlations.">The Contrasting Role of p16Ink4A Patterns of Expression in Neuroendocrine and Non-Neuroendocrine Lung Tumors: A Comprehensive Analysis with Clinicopathologic and Molecular Correlations.</a> PLoS One. 10 (12), e0144923 (2015).</li><li>Albanghali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+tissue+microarrays+from+core+needle+biopsies+-+a+systematic+literature+review.">Construction of tissue microarrays from core needle biopsies - a systematic literature review.</a> Histopathology. 68 (3), 323-332 (2016).</li><li>Navani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+evaluation+of+tissue+microarrays+in+a+high-throughput+research+project:+The+contribution+of+Indian+surgical+pathology+to+the+Human+Protein+Atlas+(HPA)+project.">Manual evaluation of tissue microarrays in a high-throughput research project: The contribution of Indian surgical pathology to the Human Protein Atlas (HPA) project.</a> Proteomics. 16 (8), 1266-1270 (2016).</li><li>Fusco, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+in+gastric+cancer:+a+digital+image+analysis+in+pre-neoplastic,+primary+and+metastatic+lesions.">HER2 in gastric cancer: a digital image analysis in pre-neoplastic, primary and metastatic lesions.</a> Mod Pathol. 26 (6), 816-824 (2013).</li><li>Amin, M. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Tumours of the Breast. , (2012).</li><li>Kononen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens.">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).</li><li>Fusco, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+quandaries:+basaloid+adenoid+cystic+carcinoma+or+breast+cylindroma?+The+role+of+massively+parallel+sequencing.">Resolving quandaries: basaloid adenoid cystic carcinoma or breast cylindroma? The role of massively parallel sequencing.</a> Histopathology. 68 (2), 262-271 (2016).</li><li>Fusco, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+events+in+the+progression+of+adenoid+cystic+carcinoma+of+the+breast+to+high-grade+triple-negative+breast+cancer.">Genetic events in the progression of adenoid cystic carcinoma of the breast to high-grade triple-negative breast cancer.</a> Mod Pathol. 29 (11), 1292-1305 (2016).</li><li>Fusco, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+NAB2-STAT6+gene+fusions+and+oestrogen+receptor-&#945;+expression+in+pulmonary+adenofibromas.">Recurrent NAB2-STAT6 gene fusions and oestrogen receptor-&#945; expression in pulmonary adenofibromas.</a> Histopathology. 70 (6), 906-917 (2017).</li><li>Hammond, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Society+of+Clinical+Oncology/College+Of+American+Pathologists+guideline+recommendations+for+immunohistochemical+testing+of+estrogen+and+progesterone+receptors+in+breast+cancer.">American Society of Clinical Oncology/College Of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer.</a> J Clin Oncol. 28 (16), 2784-2795 (2010).</li><li>Fusco, N., Bosari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+aberrations+and+heterogeneity+in+cancers+of+the+digestive+system:+Implications+for+pathologists+and+gastroenterologists.">HER2 aberrations and heterogeneity in cancers of the digestive system: Implications for pathologists and gastroenterologists.</a> World J Gastroenterol. 22 (35), 7926-7937 (2016).</li><li>Dowsett, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Ki67+in+breast+cancer:+recommendations+from+the+International+Ki67+in+Breast+Cancer+working+group.">Assessment of Ki67 in breast cancer: recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer working group.</a> J Natl Cancer Inst. 103 (22), 1656-1664 (2011).</li><li>Dekker, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+sensitivity+and+specificity+of+HER2+testing+in+breast+cancer+using+a+tissue+micro-array+approach.">Determining sensitivity and specificity of HER2 testing in breast cancer using a tissue micro-array approach.</a> Breast Cancer Res. 14 (3), R93 (2012).</li><li>De Sio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MALDI-Mass+Spectrometry+Imaging+method+applicable+to+different+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+tissues.">A MALDI-Mass Spectrometry Imaging method applicable to different formalin-fixed paraffin-embedded human tissues.</a> Mol Biosyst. 11 (6), 1507-1514 (2015).</li></ol>

저자는 관심의 충돌이 있다.

여기, 우리가 heterogeneously 처리 유방암의 높은 수율 TMAs HER2 유전자와 그 해당 centromere SISH 분석을 수행 하는 실험실 전략 세부. 이 방법은 비용 효율적 이며 유 방 암 검색 양식 병 리 기록 보관소의 큰 동료에서 HER2 유전자 증폭이 연구에 대 한 대부분 실험실에서 실시 될 수 있습니다.
때문에 HER2의 임상 중요성 유방암과 그것의 다른 유형의 식에 의해 생성 된 과제...

HER2 proto-oncogene overexpressed 이며 모든 침략 적인 유 방 암1,2의 15-30%에서 증폭 이다. HER2 overexpression의 존재에 의해 유추 됩니다 > 얼룩 (3 +), 유전자 증폭 HER2/centromere 비율은 ≥2 또는 유전자 복사 번호는 ≥6 때 평가 될 수 있다 동안에 계산에 강한 막 immunohistochemical (IHC)와 10%의 셀 제자리 교 잡 (ISH)3에 의해 최소 20 셀.
내부 종양 유전자이 바이오 마커의 평가 및 치료 응답4잠재적으로 불리 한 기여자 되 고 유방암에서 널리 설명 되었습니다. 에 따르면 대학의 미국 병리학 자 (모자), HER2 이종 존재 HER2 에 증폭 하는 경우 > 5%와 < 종양 침투의 50% 세포5. 유감 스럽게도, 유방암에서 HER2 공간이 성분의 실제 발생률 남아 병리학 사이 논쟁의 주제, 몇몇 저자는 유지 그것은 대단히 드문 이벤트와 최대를 제안 하는 다른 경우의 40%는 HER2 이기종1,5,6,7,8,,910. 이 상태를 지탱 하는 생물 학적 메커니즘에도 불구 하 고는 하지 아직 완전히 명백 하 게, 내부 종양 HER2 이종의 전조 및 임상에 미치는 영향은 유 방 암 환자11에 대 한 중요 한.
최근, 밝은 분야 분자 기술이, 발 틱 (CISH) 실버 틱 (SISH), 형광 분 (물고기)12에 비해 몇 가지 장점을 함께 FFPE 직물에서 HER2이 감지 하는 신뢰할 수 있는 방법으로 등장 했습니다. 유감 스럽게도, 단일 경우의 대량 분석 대형 코 호트 연구에서 허무 남아 있습니다. 여러 그룹 histochemistry, IHC와 ISH TMA 기술과 조합 수 암 생물학13,14,,1516의 연구에 귀중 한 전략을 나타내는 제안 했다. 이 널리 채택 된 방법으로 다른 환자에서 조직 샘플 분석할 수 있습니다 동시에, 조직 및 고용 하 고 그로 인하여 경우14의 큰 시리즈의 유니폼 분석을 육성 시 약을 최소화. 그러나, 아무 프로토콜 다른 처리 시 약, 고정 배, 및 고용, 같은 보존 방법으로 보관을 받았다 여러 조직 샘플 동시 처리량이 높은 분자 특성에 대 한 사용할 수 있습니다. 블록입니다.
유방암에서 HER2 공간이 성분의 전조와 임상 의미를 감안할 때, 우리 heterogeneously 처리 경우의 큰 시리즈에 그것을 평가 하는 통합된 분자 플랫폼을 개발 했다. 여기, 우리는 생성 하 고 SISH 통해 유방암의 높은 수율 TMAs에 HER2 증폭의 내 종양이 분석 실험실 전략 묘사. 다음 프로토콜은 측정 하는 종양에 대 한 개발 되었습니다 > 5 m m (> TNM 2017에 따르면 pT1b)17. 작은 병 변, 탈모 직렬 섹션에 분석을 수행 하는 것이 좋습니다. 우리의 절차 각각의 경우에 대 한 6 가지 영역 (범위 4-8)의 의미를 포괄 최대 30 유방암의 동시 IHC 및 SISH 분석 할 수 있습니다. 모두 180 조직 코어 직경, 코어, 그리고 그리드 가장자리 사이 2 밀리미터 사이 500 µ m에서에서 1 m m의 각 TMA 블록에 대해 생성 됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1127">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:297px;">Surgipath Paraplast</td>
			<td style="width:328px;">Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU</td>
			<td style="width:120px;">39601006</td>
			<td style="width:383px;">Tissue embedding medium, 56 &#176;C melting point</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:297px;">Eosin Y&#160; 1% water solution</td>
			<td style="width:328px;">Bio Optica, Milan, Italy, EU</td>
			<td style="width:120px;">510002</td>
			<td style="width:383px;">Eosin yellowish, water-soluble</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:297px;">Carazzi&#8217;s hematoxylin</td>
			<td style="width:328px;">Bio Optica, Milan, Italy, EU</td>
			<td style="width:120px;">506012</td>
			<td style="width:383px;">Alum hematoxylin ripened using potassium iodate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:297px;">Diamond quality</td>
			<td style="width:328px;">Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU</td>
			<td style="width:120px;">33533</td>
			<td style="width:383px;">26x76 mm microscope slides</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Leica CV Mount</td>
			<td style="width:328px;">Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU</td>
			<td style="width:120px;">14046430011</td>
			<td style="width:383px;">Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:297px;">FLEX IHC microscope slides</td>
			<td style="width:328px;">Agilent Technologies (Dako),&#160; Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:120px;">K8020</td>
			<td style="width:383px;">Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:297px;">BenchMark ULTRA</td>
			<td style="width:328px;">Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td>
			<td style="width:120px;">N750-BMKU-FS</td>
			<td style="width:383px;">Slide staining system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody</td>
			<td style="width:328px;">Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td>
			<td style="width:120px;">790-4324</td>
			<td style="width:383px;">Primary antibody, ready-to-use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody</td>
			<td style="width:328px;">Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td>
			<td style="width:120px;">790-2223</td>
			<td style="width:383px;">Primary antibody, ready-to-use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody</td>
			<td style="width:328px;">Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td>
			<td style="width:120px;">790-4286</td>
			<td style="width:383px;">Primary antibody, ready-to-use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody</td>
			<td style="width:328px;">Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td>
			<td style="width:120px;">790-4493</td>
			<td style="width:383px;">Primary antibody, ready-to-use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">ultraView Universal DAB Detection Kit</td>
			<td style="width:328px;">Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td>
			<td style="width:120px;">760-500</td>
			<td style="width:383px;">Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail</td>
			<td style="width:328px;">Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td>
			<td style="width:120px;">780-4422</td>
			<td rowspan="3" style="width:383px;">INFORM HER2 Dual ISH assay - Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">ultraView Silver ISH DNP Detection Kit</td>
			<td style="width:328px;">Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td>
			<td style="width:120px;">800-098</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">ultraView Red ISH DIG Detection Kit</td>
			<td style="width:328px;">Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td>
			<td style="width:120px;">800-505</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">ISH Protease 3</td>
			<td style="width:328px;">Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td>
			<td style="width:120px;">780-4149</td>
			<td style="width:383px;">Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Hematoxylin</td>
			<td style="width:328px;">Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td>
			<td style="width:120px;">760-2021</td>
			<td style="width:383px;">Modified Gill&#39;s hematoxylin counterstain reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Hematoxylin II Counterstaining</td>
			<td style="width:328px;">Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td>
			<td style="width:120px;">790-2208</td>
			<td style="width:383px;">Modified Meyer&#39;s hematoxylin counterstain reagent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Bluing reagent</td>
			<td style="width:328px;">Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td>
			<td style="width:120px;">760-2037</td>
			<td style="width:383px;">Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">HybReady</td>
			<td style="width:328px;">Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td>
			<td style="width:120px;">780-4409</td>
			<td style="width:383px;">Formamide-based buffer for ISH assays</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">EZ Prep (10x)</td>
			<td style="width:328px;">Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td>
			<td style="width:120px;">950-102</td>
			<td style="width:383px;">Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:297px;">SSC Buffer (10X)</td>
			<td style="width:328px;">Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td>
			<td style="width:120px;">950-110</td>
			<td style="width:383px;">Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:297px;">ULTRA LCS</td>
			<td style="width:328px;">Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td>
			<td style="width:120px;">650-210</td>
			<td style="width:383px;">Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Reaction Buffer (10x)</td>
			<td style="width:328px;">Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td>
			<td style="width:120px;">950-300</td>
			<td style="width:383px;">Tris based buffer solution (pH 7.6 &#177; 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)</td>
			<td style="width:328px;">Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td>
			<td style="width:120px;">950-223</td>
			<td rowspan="2" style="width:383px;">Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1)</td>
			<td style="width:328px;">Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td>
			<td style="width:120px;">950-224</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">ultraView Silver Wash II</td>
			<td style="width:328px;">Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td>
			<td style="width:120px;">780-003</td>
			<td style="width:383px;">Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:297px;">Microtome</td>
			<td style="width:328px;">Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU</td>
			<td style="width:120px;">RM 2255</td>
			<td style="width:383px;">Automated rotary microtome</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:297px;">Multistainer</td>
			<td style="width:328px;">Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU</td>
			<td style="width:120px;">ST 5020</td>
			<td style="width:383px;">Workstation for automated staining and coverslipping</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Minicore 1</td>
			<td style="width:328px;">Alphelys, Plaisir, France, EU</td>
			<td style="width:120px;">00-MICO-1</td>
			<td style="width:383px;">Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:297px;">Aperio ScanScope CS2</td>
			<td style="width:328px;">Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU</td>
			<td style="width:120px;">K080254</td>
			<td style="width:383px;">Image capture device - digital pathology scanner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue-Tek III Uni-Cassette</td>
			<td>Sakura Finetek Europe B.V</td>
			<td style="width:120px;">4135</td>
			<td>Cassette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold</td>
			<td>Sakura Finetek Europe B.V</td>
			<td style="width:120px;">7055</td>
			<td>Stainless-Steel base metal mold</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

building up a high-throughput screening platform to assess the heterogeneity of her2 gene amplification in breast cancers

인간 표 피 성장 인자 수용 체 2 (HER2)에 대 한 표적으로 한 치료 HER2-양성 유방암 환자의 결과 근본적으로 변경. 그러나,의 경우 소수 주요 임상 과제 생성 HER2 양성 세포의 유형이 다른 분포를 표시 합니다. 날짜 하려면, 특성화 및 큰 동료에서 HER2 이기종 유전자 증폭의 정량화에 더 안정적이 고 표준화 된 프로토콜 제안 되었습니다. 여기, 우리는 동시에 여러 개의 유방암의 다른 지형 지역에 걸쳐 HER2 상태를 평가 하는 높은 처리량 방법 제시. 특히, 우리는 향상 된 조직 microarrays (TMAs) 종양의 대상된 매핑 통합을 구성 하는 실험실 절차를 설명 합니다. 모든 TMA 매개 변수는은 제자리에서 교 잡 (SISH)의 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 유 방 조직에 대 한 특별히 최적화 되었습니다 했습니다. (즉, ER, PR, Ki67, 그리고 HER2) 전조 및 예측 생체의 Immunohistochemical 분석 자동화 된 절차를 사용 하 여 수행 되어야 한다. 사용자 지정된 SISH 프로토콜은 다른 고정, 처리 및 저장 프로시저를 받았다 여러 조직에 걸쳐 높은-품질 분자 분석을 수 있도록 구현 되었습니다. 이 연구에서 우리는 증거--방침의 특정 DNA 시퀀스 heterogeneously 처리 되 고 여러 가지 지형 영역에 동시에 지역화 된 유방암 효율적이 고 비용 효율적인 방법을 사용 하 여 수를 제공 합니다.

전반적으로, 444 침략 적인 유 방 암 15 TMAs 분 분석 최적화에 반영 되었습니다. 샘플링 2,664 명소 중 2,651 (99.5%) 이전에 선택한 분야의 대표 되었고 따라서 후속 분석에 대 한 순종으로 간주. 내 종양이 종양의 독특한 지형 지역에 HER2 양성 클론의 유형이 다른 배포판에 특정 초점 IHC 및 SIH, 결정 되었다. 표 3 은 다른 histotypes에서 ER, PR, Ki67, HER2 상태에 초점을 맞추?...

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Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

HER2 양성 세포의 다른 유형의 배포 유방암의 하위 집합에서 관찰 될 수 있다 고 임상 딜레마를 생성 합니다. 여기, 정의 계량, HER2 내부 종양 유전자이 heterogeneously 처리 유방암의 큰 시리즈에 비교 하는 안정적이 고 비용 효율적인 프로토콜을 소개 합니다.

유방암에서 HER2 유전자 증폭의이 질을 평가 하기 위해 높은 처리량 검열 플랫폼을 구축

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K 조회수.  Fondazione IRCCS Ca' Granda, Ospedale Maggiore Policlinico. HER2 양성 세포의 다른 유형의 배포 유방암의 하위 집합에서 관찰 될 수 있다 고 임상 딜레마를 생성 합니다. 여기, 정의 계량, HER2 내부 종양 유전자이 heterogeneously 처리 유방암의 큰 시리즈에 비교 하는 안정적이 고 비용 효율적인 프로토콜을 소개 합니다.

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An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

<em&gt; 체외</em인간 대식 세포의 분화와 양극화의 이질성을 연구&gt; 모델

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

연구

면역학 및 감염병학

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

RNA 바이러스의 넓은 스펙트럼 화학 억제를위한 높은 처리량 검사

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

높은 처리량 유전자 태그에<em&gt; 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

평가 하 고 호 중구 Extracellular 함정 대형 계량 높은 처리량 분석 결과

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. They are an important health concern as they have been associated with recurrent chronic infections. Although stochastic and deterministic dynamics of stress-related mechanisms are known to play a significant role in persistence, mechanisms underlying the phenotypic switch to/from the persistence state are not completely understood. While persistence factors triggered by environmental signals (e.g., depletion of carbon, nitrogen and oxygen sources) have been extensively studied, the impacts of osmolytes on persistence are yet to be determined. Using microarrays (i.e., 96 well plates containing various chemicals), we have designed an approach to elucidate the effects of various osmolytes on Escherichia coli persistence in a high throughput manner. This approach is transformative as it can be readily adapted for other screening arrays, such as drug panels and gene knockout libraries.

In this method paper, we present a high-throughput screening strategy to identify chemical compounds, such as osmolytes, that have a significant impact on bacterial persistence.

세균성 지속성에 미치는 영향을 밝히기 위해 화학 화합물의 높은 처리량 선별

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of the disease.&#160;To study such processes, researchers can use high-throughput sequencing techniques (RNA-seq) that measure the dynamic changes of the host transcriptome at different stages of infection, clinical outcomes, or disease severity.This investigation can lead to a better understanding of the diseases, as well as uncovering potential drug targets and treatments. The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing data from raw reads to functional analysis. The pipeline is divided into five steps: (1) quality control of the data; (2) mapping and annotation of genes; (3) statistical analysis to identify differentially expressed genes and co-expressed genes; (4) determination of the molecular degree of the perturbation of samples; and (5) functional analysis. Step 1 removes technical artifacts that may impact the quality of downstream analyses. In step 2, genes are mapped and annotated according to standard library protocols.&#160;The statistical analysis in step 3 identifies genes that are differentially expressed or co-expressed in infected samples, in comparison with non-infected ones. Sample variability and the presence of potential biological outliers are verified using the molecular degree of perturbation approach in step 4. Finally, the functional analysis in step 5 reveals the pathways associated with the disease phenotype. The presented pipeline aims to support researchers through the RNA-seq data analysis from host-pathogen interaction studies and drive future&#160;in vitro or in vivo experiments, that are essential to understand the molecular mechanism of infections.

The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing transcriptome data from raw reads to functional analysis, including quality control and preprocessing steps to advanced statistical analytical approaches.

호스트-병원체 상호 작용을 조사하기 위한 고처리량 전사 분석

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...