여기에 설명된 프로토콜은 높은 처리량 방식으로 세균 지속성에 크게 영향을 미칠 수 있는 조건을 식별할 수 있게 합니다. 이 방법은 약물 패널, 유전자 라이브러리 등과 같은 다양한 영역에 대한 화면에 쉽게 적응할 수 있습니다. 이 방법에는 동시에 실시되어야 하는 다양한 서브 단계가 포함되어 있기 때문에, 시각적 데모는 연구원이 정확한 결과를 얻기 위해 타이밍을 관리하는 데 도움이 될 수 있습니다.
마이크로어레이 세포 배양을 준비하는 것으로 시작합니다. 50 밀리리터 원심분리기 튜브에서 25밀리리터의 신선한 변형 LB 배지에 지수상 세포의 250마이크로리터를 전달한다. 그런 다음 셀 현탁액을 부드럽게 혼합하여 균일하게 만듭니다.
희석된 세포 현탁액을 멸균 50 밀리리터 저수지로 옮기다. 다중 채널 파이펫을 사용하여, 다양한 화학 물질을 포함하는 마이크로 어레이 플레이트의 각 웰에 셀 서스펜션의 150 마이크로 리터를 전송. 마이크로어레이는 텍스트 원고에 설명된 메서드에 따라 수동으로 생성될 수도 있습니다.
마이크로어레이 플레이트를 가스 투과성 천장 멤브레인으로 덮고 섭씨 37도, RPM 250에서 24시간 동안 궤도 셰이커에 배양합니다. 퍼시언니 분석 판을 만들려면 50밀리리터 원심분리기 튜브에 Ofloxacin의 밀리리터 당 5 마이크로그램을 포함하는 수정된 LB 배지 25밀리리터를 준비하고 이 매체를 멸균 저수지로 옮길 수 있습니다. 수정된 LB 배지의 190마이크로리터를 일반 평면 바닥(96)의 각 웰으로 옮기다.
24시간 인큐베이션 후, 셰이커로부터 마이크로어레이를 제거하고 세포 배양10마이크로리터를 마이크로어레이에서 Ofloxacin을 함유한 배구 분석 플레이트의 우물까지 이송한다. 10 마이크로리터의 세포 현탁액을 퍼sister 에세이 플레이트에서 가져 와서 라운드 하단 96 웰 플레이트와 멀티 채널 파이펫을 사용하여 PBS 용액 의 290 마이크로 리터에서 세 번 연속적으로 희석하십시오. 그런 다음 항생제 무료 신선한 한천 접시에 모든 연속적으로 희석 된 세포 현탁액의 10 마이크로 리터를 발견하십시오.
퍼시언니 분석판을 가스 투과성 천장 멤브레인으로 덮고 6시간 동안 섭씨 37도, RPM 250의 궤도 셰이커에 배양합니다. 6시간 의 배양 후, 일련 희석을 반복하고 한천 접시에 발견한다. 37°C에서 16시간 동안 한천 접시를 배양합니다.
그런 다음 식민지 형성 단위 또는 CfU를 계산합니다. 항생제 치료 전후 6시간 전과 6시간 후에 CFU 수준을 사용하여 각 우물에서 persister 분획을 계산합니다. OfX 처리의 앞에 CFU 는 또한 e coli 생존가능성에 osmolites의 효력을 평가하는 것을 돕습니다.
마이크로어레이 스크리닝에서 확인된 오스몰라이트를 함유한 신선한 변형 LB 배지의 25밀리리터에 지수상 세포의 250마이크로리터를 전달한다. 250 RPM과 섭씨 37도에서 24시간 동안 플라스크를 궤도 셰이커에 배양합니다. 24시간 후, 셰이커에서 플라스크를 제거하고 250 밀리리터 배플 플라스크에서 25밀리리터의 신선한 변형 LB 배지 25밀리리터로 세포 배양의 250 마이크로리터를 이송한다.
Ofloxacin 스톡 용액 25마이크로리터를 세포 현탁액에 넣고 플라스크를 부드럽게 흔들어 분석 문화를 균질하게 만듭니다. 플라스크를 섭씨 37도, RPM 250도에서 셰이커에 배양합니다. Ofloxacin을 추가하기 전에 시간 지점을 포함하여 치료 중 매 시간마다 플라스크에서 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리튜브로 분석 문화의 1 밀리리터를 전송하고 원심분리기는 17, 000회 G에서 3분 동안 전송합니다.
950 마이크로리터의 상체를 제거하고 PBS의 950 마이크로리터로 세포를 세 번 씻으시다. 최종 세척 후, PBS 용액의 100 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 셀 서스펜션의 10 마이크로리터를 복용하고 96 개의 잘 둥근 바닥 플레이트 내부에 PBS의 90 마이크로 리터로 6 번 연속적으로 희석하십시오.
항생제 없는 한천 판에 희석된 세포 현탁액의 10마이크로리터를 반점하십시오. 검출 의 한계를 증가시키기 위하여는, 신선한 한천 접시에 셀 현탁액의 나머지 90 마이크로리터를 접시. 16시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양한 다음 CfU를 계산합니다.
OFX 치료 전후세포 배양의 CFU 수준을 결정하는 데 사용되는 한천 플레이트의 대표적인 이미지가 여기에 나와 있다. 첫 번째 열은 컨트롤 그룹입니다. 두 번째 컬럼에는 질산나트륨 100밀리머나트륨으로 배양된 세포가 있으며, 세 번째 컬럼에는 질산나트륨 60밀리머 나트륨으로 배양된 세포가 포함되어 있다.
단순성으로 는 두 개의 osmolites만이 여기에 집중됩니다. 96개의 웰 플레이트에서 테스트된 세포 배양의 플레이트 및 퍼시누분수로부터의 CFU 데이터의 그래픽 표현이 여기에 나와 있다. 분획을 계산하기 위해, persister 수는 항생제 치료 전에 얻은 세포 수로 정규화되었다.
세포는 25밀리리터의 수정된 LB 배지에서 24시간 동안 표시된 오스몰라이트와 당황한 플라스크로 배양한 다음, 퍼시누열 열거곡에 대한 인가 분석 플라스크로 옮겨졌다. 이 프로토콜을 시도할 때, 한천 판에 세포를 발견하는 것은 노동 집약적이며 초점이 필요하다는 것을 명심하십시오. 단계 중 오류는 테스트 중인 조건 중 교차 오염으로 이어질 수 있습니다.
따라서 실험 전에 동시에 여러 샘플을 발견하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에 따라 약물 패널 및 돌연변이 세포 라이브러리를 선별하여 지속성에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다. 이 검열을 통해, 우리는 세균성 지속성에 중요한 충격이 있는 osmolites 및 PS 조건의 수를 확인했습니다.
