이 방법은 노노세포 해부 및 지질 방울 얼룩염색의 이 방법은 정상 및 스트레스 조건 하에서 drosophila 애벌레 oenocyte에서 지질 방울의 외관을 실현하기 위하여 이용될 수 있다. 이 방법은 곤충뿐만 아니라 몇 가지 사소한 수정과 포유류에서 지질 대사를 연구하기위한 유용한 도구를 제공합니다. 계란 누워를 유도하기 위해, 계란 누워 병에 원하는 유전자형의 150 처녀 여성 파리와 75 수컷을 배치하고 60 %의 습도와 25섭씨 25도 인큐베이터에 방광 상자 아래에 병을 배치합니다.
1시간 후, 파리를 새 병으로 옮기고 파리가 새 병에 알을 낳은 후 성인을 제거하십시오. 그런 다음, 계란은 12 시간 밝은 어두운 주기와 섭씨 25도에서 84 시간 동안 세 번째 별 애벌레로 발전 할 수 있습니다. 기아 치료를 시작하기 전에 적당히 크기의 필터 용지를 6센티미터 페트리 접시에 넣고 PBS 1밀리리터를 종이에 추가하여 기아 챔버를 만듭니다.
제어 처리 챔버를 만들기 위해, 6 센티미터 페트리 접시에 블루밍턴 표준 옥수수 가루 식품의 5 밀리리터를 배치합니다. 챔버가 준비되면 작은 페인트 브러시를 사용하여 달걀 누워 병에서 동일한 대략적인 크기의 별 애벌레를 수집합니다. 그리고 각 기아 및 대조실로 무작위로 20 애벌레.
그런 다음 12, 24 또는 36 시간의 개발 및 / 또는 기아를 위해 인큐베이터에 챔버를 배치합니다. 치료 기간이 끝나면 집게를 사용하여 각 챔버에서 유충을 얼음 차가운 PBS가 들어있는 해부 판으로 부드럽게 옮기고 접시를 스테레오 현미경 아래에 놓습니다. 첫 번째 애벌레 복부 면을 위로 향하게 하고 집게를 사용하여 애벌레를 제자리에 부드럽게 잡습니다.
한 핀을 인두를 통해, 또 다른 핀을 첨탑을 통과하여 접시에 애벌레를 고정시하십시오. Vannas 스프링 가위를 사용하여 앞쪽에서 동물의 후면 끝까지 표피를 통해 세로 절개를 합니다. 표피의 내부 표면에 있는 장신구의 손상을 피하기 위해 주시하면서, 표피의 내부 조직을 제거하기 위해 집게를 사용합니다.
그런 다음 집게를 사용하여 해부 핀을 검색하고 표피를 얼음에 PBS의 1.5 밀리리터 미세 원심 분리 튜브로 전송합니다. 지질 방울 염색의 경우 회전기의 실온에서 30분 동안 고정 버퍼에서 해부된 표피를 배양한 다음 PBS의 1밀리리터에서 빠른 재서스펜션을 수행합니다. 그런 다음 세척당 PBS 1밀리리터에 3개의 5분 세척으로 샘플을 세척하여 잔류 고정을 제거합니다.
마지막 세척 후, 회전기의 실온에서 30 분 동안 적절한 리포필 프로브로 표피 샘플을 배양하십시오. 인큐베이션 하는 동안, 빛으로부터 조직을 보호하기 위해 호일에 샘플 튜브를 감싸고 세척 당 10 분 동안 PBS의 1 밀리리터에 샘플을 세 번 세척합니다. 이노클을 이미지하기 위해 각 표피 샘플을 깨끗한 현미경 슬라이드에 장착 매체의 6 마이크로 리터로 옮기고 조직의 방향을 조정하여 노이노사이클을 함유한 내부 표면이 슬라이드의 바닥에 닿도록 한다.
뚜껑을 표피에 부드럽게 놓고 맑은 매니큐어로 가장자리를 밀봉합니다. 폴란드어가 건조되면, 공초점 현미경에 샘플을 이미지, 적절한 여기와 방출 파장을 가진 63 X 배율을 넣어. 다른 발달 단계에서 정상적인 먹이 애벌레의 이노사이클 안에 는 몇 가지 검출 가능한 지질 방울이 있습니다.
그러나 이러한 대표적인 이미지에서 관찰된 바와 같이, 지질 방울은 12, 24 및 36시간 기아 기간에 대한 응답으로 이뇨제 내의 수가 증가합니다. 이 방법은 관련 연구 분야의 연구원들이 유전적 또는 환경 조작으로 인해 세포에 지질 방울 변화를 유발하는지 여부를 조사할 수 있는 실현 가능한 프로토콜을 제공하고 쉽고 쉽게 제공합니다.
