이 게시는 유럽 연합의 수평선 2020 연구에 의해 투자 되었다 및 혁신 프로그램 마리 Sklodowska 퀴리 부여 계약 없음 642893 (감동), 비용 사무실 (비용 액션 FA 1205, AQUAGAMETE), 그리고 우수 연구 센터- 1476-4/2016/FEKUT입니다.

이 프로토콜에서 설명 하는 유럽 장 어와 함께 작업 하기 위한 모든 절차는 위원회의 윤리의 동물 실험 Universitat Politècnica de València, 스페인 법률 및 규정 제어 실험에 의해 승인 및 살아있는 동물에 절차입니다.
1. 물고기 유지 보수
<ol><li>연구 시설에 유럽 뱀장어를 가져오고 재순환 시스템 200 L 수족관에 넣어. 20 ° C에서 일정 한 온도 유지 하기 위해 온도 쿨러를 사용 합니다.</li>
	<li>실험 기간 동안 물고기 음식와 스트레스22 를 피하기 위해 어두운 조건에서 유지.</li>
	<li>첫 3 일 동안 신선한 물에서 물고기를 유지. 다음 물 1/3을 변경 하 고 해 수 37.0 ±의 염 분을 도달할 때까지 매일 리필 0.3 g/l.</li>
</ol>2. 호르몬 치료
참고: 호르몬 치료는 실험의 전체 기간 (9 주)을 통해 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG)의 주간 주사의 구성 되어 있습니다.
<ol><li>1 IU / µ L의 농도에서 미리 hCG 호르몬 호르몬 생리 식 염 수에 희석 하 여 준비 (0.9 %NaCl). 참고: 호르몬 보존 될 수 있습니다-18 ° c.에 1 주일 이상에 대 한이 농도에 희석</li>
	<li>Anesthetize 물고기, 시스템 물 5 l 40 L 유연한 물통을 준비 합니다.<ol>
<li>250 mL 플라스 크에 300mg benzocaine 70% 에탄올 100ml에 희석.</li>
		<li>양동이에 희석된 benzocaine를 부 어 (최종 농도 0.36 m m)와 적절히 섞어. 이것은 60 mg/l.의 최종 benzocaine 농도 대 한</li>
		<li>Benzocaine와 물으로, 물고기를 개별적으로 전송 하 고는 benzocaine 적용 됩니다 물고기 제대로 마 취 될 때까지 몇 초를 기다립니다. 참고: 물고기 취 것인지 물고기 부정사 자리에 놓고 그것은 여전히 그 자리에에서 유지 하는 확인 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>호르몬 관리, 무게 물고기 고 물고기, 1.5 mL 플라스틱 튜브에서의 1.5 IU/g의 복용량에 hCG 호르몬을 준비.<ol>
<li>플라스틱 튜브에서 hCG 호르몬을 1 mL 주사기를 채우십시오.</li>
		<li>복 지역에서 신중 하 게 호르몬을 주입, 부정사 위치와 도움 또는 주사기 마 취 물고기를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>물고기는 수족관에 반환 하 고 완전히 복구 될 때까지 그것을 모니터링 합니다. 참고: 호르몬 관리는 실험 내내 매주 실시 하는. 일반적으로, 유럽 뱀장어는 호르몬 치료의 6-7 주 후 spermating를 시작합니다.</li>
</ol>3. 정자 샘플링
<ol><li>최고의 품질 샘플을 얻기 위해 호르몬 관리6,23후 정자 24 h를 추출 합니다.</li>
	<li>2.2 단계에 설명 된 대로 benzocaine와 물고기를 anesthetize.</li>
	<li>부정사 위치에 마 취 물고기를 배치, 증류수의 물 총으로 성 기 영역을 청소 하 고 종이 수족관에서 해 수와 접촉 하 여 배설물 오염 음부 나 실수로 정자 활성화를 방지 하려면 신중 하 게 건조.</li>
	<li>물고기의 측면 양쪽에 손가락을 배치, 신중 하 게 누르면 옆으로 가슴 지 느 러 미에서 성 기 영역을 밖으로 정자를 마사지.<ol>
<li>마사지를 반복 하 여 더 더 정자 생식 기 오프닝에서 나온다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>15 mL 플라스틱 튜브 진공 펌프를 사용 하 여 정자를 수집 합니다.</li>
	<li>4 º C에서 수정된 Tanaka´s 익스텐더 솔루션24 (137 m m NaCl, 76.2 m m NaHCO3, 증류수에)에서 추출한 정자 1시 10분 희석. 참고: extender 솔루션에 정자 4 º C에서 유지 되어야 합니다.</li>
</ol>4. 정자 품질 평가
<ol><li>인공 해 수13 준비 (mm에서: NaCl 354.7, MgCl2 52.4, CaCl2 9.9, 나2등4 28.2, KCl 9.4, 증류수에) 2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) (w:v), pH 8.2, osmolality 1100 mOsm/kg를 조정 하 고 유지 그것은 박테리아의 성장을 피하기 위해 4 º C에서.</li>
	<li>컴퓨터 기반 정자 분석 (카사)에 대 한 소프트웨어를 열고 물고기 정자 모듈을 선택 합니다.<ol>
<li>소프트웨어의 시스템 설치 프로그램을 열려면 속성 클릭 하십시오. 거기, 초당 60 이미지에서 캡처 옵션을 설정 합니다. 선택 부정적인 단계 광학, Makler 챔버와 10 배 규모.</li>
		<li>다음 분석 값에 종 및 입자 영역 2 µ m2 보다 크고 20 µ m2보다 작은 물고기 를 선택 합니다.</li>
		<li>속도 매개 변수를 설정 느린 때 셀 10 그리고 45 µ m/s 사이 이동, 45, 100 µ m/s 사이 이동할 때 보통 으로 설정 빠른 100 µ m/s 보다 빠르게 이동 하는 경우. 참고: 10 µ m/s 보다 느린 속도와 정 충 immotile 간주 됐다.</li>
		<li>직진도 (STR)의 80%로 진보적인 가치를 선택 하 고 속성을 저장 합니다.</li>
		<li>캡처 필드 (카메라에서 라이브 이미지 창이 열립니다)를 클릭 하십시오. 참고: 컴퓨터 기반 정자 분석 시스템 현미경, 카메라 및 이미지 분석 소프트웨어에 의해 형성 된다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세 실에 인공 해 수의 4 µ L를 넣어 하 고 정자 솔루션 (정자 익스텐더 솔루션에 희석)의 0.5 µ L를 추가 합니다.<ol>
<li>이미지에 부정적인 단계에 10 배 확대 현미경 초점. 15 활성화 후 s 클릭 캡처-비디오에서 컴퓨터 기반 정자 분석 소프트웨어에서.</li>
		<li>Cryopreservation 70% 보다 높은 운동 성을 가진 triplicate 선택 샘플에서 모든 샘플을 분석 합니다. 참고: 그것은 매우이 cryopreservation 프로토콜의 성공에 대 한 높은-품질 정자만을 선택 하는 것이 중요입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 정자 동결 방법
<ol><li>34 cm x 34 cm x 30 cm 및 5 cm 두꺼운 스티로폼 상자에서에서 사전에 액체 질소 (약 2.5 L)를 준비 합니다. 참고: 항상 액체 질소의 4-5 cm 높이의 레벨을 유지 합니다.<ol>
<li>전 정자를 동결 부동 구조 구축. 폴리스 티 렌 (20 cm x 5 cm)의 2 개를 사용 하 여, 2 플라스틱 튜브와 함께 그들을 바인딩할 하 고 액체 질소에 구조를 놓습니다. 이 구조는 표면 (그림 1)에 3 cm의 대략적인 높이에 액체 질소를 통해 플 로트 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56835/56835fig1.jpg"> 그림 1 . 미리 이상의 액체 질소 냉동에 사용 되는 부동 구조 그리기 도식. 구조는 낮은 밀도 20 cm x 4 cm x 5의 스티로폼의 두 부분으로 구성 됩니다 cm 14 c m의 플라스틱 튜브와 연결. 빨 대는 액체 질소에 3 cm에 플라스틱 튜브를 통해 배치 됩니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56835/56835fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="2"><li>정자, 익스텐더 솔루션 및 메탄올 1의 비율로 혼합 하 여 cryopreservation 솔루션 준비: 8:1 1.5 mL 플라스틱에서 튜브, 부드럽게 저 어.</li>
	<li>피 펫의 도움으로 500 µ L 빨 대에 cryopreservation 솔루션의 480 µ L을 추가 하 고 필요 하다 면, 클레이 모델링 한 끝을 폐쇄 하 여 표시 합니다.</li>
	<li>3 분 액체 질소에 3 cm의 고도에 떠 있는 장치에 빨 대를 넣어. 그런 다음 액체 질소에 빨 대를 놓습니다.</li>
	<li>10-15 분 후 긴 집게를 사용 하 여 액체 질소 저장 탱크에 빨 대를 전송 하 고 항상 액체 질소에 빠져들 유지 합니다. 여기, 정자는 무기한으로 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>6. 해 동 방법
<ol><li>5.1, 단계에서 설명한 대로 액체 질소로 스티로폼 상자를 준비 하 고 준비 물 목욕 40 º C에서 수돗물 3l 비 커를 사용 하 여.</li>
	<li>긴 집게를 사용 하 여 액체 질소 저장 탱크 스티로폼 상자에 냉동된 정자를 빨 대 전송.<ol>
<li>13 40 º C에서 물 목욕으로 각 빨 대를 넣어 s.</li>
		<li>가 위로 빨 대의 닫힌된 끝을 절단 하 여 1.5 mL 플라스틱 관으로 정자를 붓는 다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4.1 단계에 설명 된 대로 컴퓨터 기반 정자 분석 시스템을 사용 하 여 정자의 운동 성 분석.</li>
	<li>교류 cytometer와 정 충의 생존 능력을 분석 하는 정자의 100 µ L를 유지.</li>
</ol>7. Cytometry
<ol><li>Propidium 요오드 화물 (PI), 죽은 세포의 핵을 얼룩 빨간 형광 화합물 이며 녹색 살아있는 세포의 핵 얼룩 막 permeant 핵 형광 성 화합물을 포함 하는 형광 키트를 사용 합니다.<ol>
<li>100 µ M의 작업 솔루션 Tanaka´s 매체에 재고 솔루션 (1mm) 1시 10분에서 그것을 diluting 하 여 녹색 형광 얼룩 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>PI 솔루션을 희석 하지 마십시오. 2.4 m m 재고 솔루션이입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 샘플에 대 한 신선한 또는 해 동 정자의 50 µ L 고 작업 솔루션 (최종 농도 1 µ M)를 착 색 하는 녹색 형광의 0.5 µ L을 추가 하 고 PI 솔루션 (최종 농도 100 µ M)의 2 µ L.</li>
	<li>5 분 동안 어둠 속에서 염료 (PI와 녹색 형광 성 얼룩)를 포함 하는 샘플을 품 어.<ol>
<li>Tanaka´s 익스텐더 솔루션의 500 µ L의 샘플을 희석 하 고 교류 cytometer 분석.</li>
	</ol>
</li>
	<li>교류 cytometer 설정 하 고 적어도 2 음모를 포함 하는 새로운 프로토콜을 만들: SS 대 FS 로그 및 FL1 vs FL3 로그. 참고: 두, 녹색 형광 얼룩이 지 고 propidium 요오드 화물 보이는 파장 빛으로 흥분 수 있습니다. DNA에 바인딩된 경우,이 염료의 최대 형광 방출은 516 및 617 nm, 각각.<ol>
<li>다른 레이저의 전압 조정: SS = 199; FS = 199; FL1 377; = FL3 = 372</li>
		<li>최대 이벤트 수집 설정 협정 설정 = 5000 또는 15 s (샘플의 최종 농도 약 1 백만 셀/mL의 해야 함). 낮 은 흐름을 사용 하 여 샘플을 읽기.</li>
		<li>읽기 모드 단일 튜브 고정 위치 모드를선택 합니다.</li>
		<li>회전 목마의 오른쪽 숫자에 샘플을 넣어</li>
		<li>(F 9를 누르면) 샘플을 읽고 고 추가 분석에 대 한 (f 7을 누르면) excel 파일에 수집 된 데이터를 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>ICES_Working_Group_on_Eels. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Report of the 2011 Session of the Joint EIFAAC/ICES Working Group on Eels. , 246 (2011).</li><li>Moriarty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Catches+of+Elver+of+1928-1988.">European Catches of Elver of 1928-1988.</a> Int. Rev. Hydrobiol. 75 (6), 701-706 (1990).</li><li>Dekker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractal+geometry+of+the+European+eel+stock.">The fractal geometry of the European eel stock.</a> ICES J. Mar. Sci. 57 (1), 109-121 (2000).</li><li>Jacoby, D., Gollock, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anguilla anguilla. The IUCN red list of threatened species. Version 2014.2. , (2014).</li><li>Asturiano, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hCG+as+spermiation+inducer+on+European+eel+semen+quality.">Effects of hCG as spermiation inducer on European eel semen quality.</a> Theriogenology. 66 (4), 1012-1020 (2006).</li><li>P&#233;rez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+maturation+and+spermiation+in+the+male+European+eel:+assessment+of+sperm+quality+throughout+treatment.">Induction of maturation and spermiation in the male European eel: assessment of sperm quality throughout treatment.</a> J. Fish Biol. 57 (6), 1488-1504 (2000).</li><li>Gallego, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+effects+of+thermal+regime+and+alternative+hormonal+treatments+on+the+reproductive+performance+of+European+eel+males+(Anguilla+anguilla)+during+induced+sexual+maturation.">Study of the effects of thermal regime and alternative hormonal treatments on the reproductive performance of European eel males (Anguilla anguilla) during induced sexual maturation.</a> Aquaculture. 354, 7-16 (2012).</li><li>Asturiano, J. F., S&#248;rensen, S. R., P&#233;rez, L., Lauesen, P., Tomkiewicz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Production+of+Larvae+Using+Cryopreserved+Sperm:+Effects+of+Preservation+Temperature+and+Cryopreservation+on+European+Eel+Sperm+Fertilization+Capacity.">First Production of Larvae Using Cryopreserved Sperm: Effects of Preservation Temperature and Cryopreservation on European Eel Sperm Fertilization Capacity.</a> Reprod. Domestic Anim. 51 (4), 485-491 (2016).</li><li>Di Biase, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-treatment+with+androgens+during+artificial+induction+of+maturation+in+female+eel,+Anguilla+anguilla:+Effects+on+egg+production+and+early+development.">Co-treatment with androgens during artificial induction of maturation in female eel, Anguilla anguilla: Effects on egg production and early development.</a> Aquaculture. 479, 508-515 (2017).</li><li>Lokman, P., Wylie, M. J., Downes, M., Di Biase, A., Damsteegt, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+induction+of+maturation+in+female+silver+eels,+Anguilla+australis:+The+benefits+of+androgen+pre-treatment.">Artificial induction of maturation in female silver eels, Anguilla australis: The benefits of androgen pre-treatment.</a> Aquaculture. 437, 111-119 (2015).</li><li>Mylonas, C. C., Duncan, N. J., Asturiano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+manipulations+for+the+enhancement+of+sperm+production+in+cultured+fish+and+evaluation+of+sperm+quality.">Hormonal manipulations for the enhancement of sperm production in cultured fish and evaluation of sperm quality.</a> Aquaculture. , (2016).</li><li>Ohta, H., Izawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diluent+for+cool+storage+of+the+Japanese+eel+(Anguilla+japonica)+spermatozoa.">Diluent for cool storage of the Japanese eel (Anguilla japonica) spermatozoa.</a> Aquaculture. 142 (1-2), 107-118 (1996).</li><li>Pe&#241;aranda, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Eel+Sperm+Diluent+for+Short-term+Storage.">European Eel Sperm Diluent for Short-term Storage.</a> Reprod. Domestic Anim. 45 (3), 407-415 (2010).</li><li>Ohta, H., Kagawa, H., Tanaka, H., Unuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+by+the+environmental+concentration+of+ions+of+the+potential+for+motility+in+Japanese+eel+spermatozoa.">Control by the environmental concentration of ions of the potential for motility in Japanese eel spermatozoa.</a> Aquaculture. 198 (3), 339-351 (2001).</li><li>Asturiano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+and+methods+for+the+cryopreservation+of+European+eel+(Anguilla+anguilla)+sperm.">Media and methods for the cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm.</a> Fish Physiol. Biochem. 28 (1), 501-502 (2003).</li><li>Asturiano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physio-chemical+characteristics+of+seminal+plasma+and+development+of+media+and+methods+for+the+cryopreservation+of+European+eel+sperm.">Physio-chemical characteristics of seminal plasma and development of media and methods for the cryopreservation of European eel sperm.</a> Fish Physiol. Biochem. 30 (3), 283-293 (2004).</li><li>Szab&#243;, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+European+eel+(Anguilla+anguilla)+sperm+using+different+extenders+and+cryoprotectants.">Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm using different extenders and cryoprotectants.</a> Acta. Biol. Hung. 56 (1-2), 173-175 (2005).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+sperm+of+farmed+European+eel+Anguilla+anguilla.">Cryopreservation of sperm of farmed European eel Anguilla anguilla.</a> J World Aquac Soc. 35 (2), 225-231 (2004).</li><li>Pe&#241;aranda, D. S., P&#233;rez, L., Gallego, V., Jover, M., Asturiano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+European+eel+sperm+cryopreservation+method+by+preventing+spermatozoa+movement+activation+caused+by+cryoprotectants.">Improvement of European eel sperm cryopreservation method by preventing spermatozoa movement activation caused by cryoprotectants.</a> Cryobiology. 59 (2), 119-126 (2009).</li><li>Marco-Jim&#233;nez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+European+eel+(Anguilla+anguilla)+spermatozoa:+effect+of+dilution+ratio,+foetal+bovine+serum+supplementation,+and+cryoprotectants.">Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) spermatozoa: effect of dilution ratio, foetal bovine serum supplementation, and cryoprotectants.</a> Cryobiology. 53 (1), 51-57 (2006).</li><li>Asturiano, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+sperm+cryopreservation+on+the+European+eel+sperm+viability+and+spermatozoa+morphology.">Effect of sperm cryopreservation on the European eel sperm viability and spermatozoa morphology.</a> Reprod. Domestic Anim. 42 (2), 162-166 (2007).</li><li>Mordenti, M., Di Biase, A., Sirri, R., Modugno, S., Tasselli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Sexual+Maturation+in+Wild+Female+European+Eels+(Anguilla+anguilla)+in+Darkness+and+Light.">Induction of Sexual Maturation in Wild Female European Eels (Anguilla anguilla) in Darkness and Light.</a> Isr. J. Aquac. 64, (2012).</li><li>Ohta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+induction+of+maturation+and+fertilization+in+the+Japanese+eel,+Anguilla+japonica.">Artificial induction of maturation and fertilization in the Japanese eel, Anguilla japonica.</a> Fish Physiol. Biochem. 17 (1), 163-169 (1997).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cryopreservation+of+sperm+of+Japanese+eel.">Long-term cryopreservation of sperm of Japanese eel.</a> J. Fish Biol. 60 (1), 139-146 (2002).</li><li>Gallego, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulation+pattern+of+eel+spermatozoa+is+affected+by+post-activation+time,+hormonal+treatment+and+the+thermal+regimen.">Subpopulation pattern of eel spermatozoa is affected by post-activation time, hormonal treatment and the thermal regimen.</a> Reprod. Fertil. Dev. 27 (3), 529-543 (2015).</li><li>Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horv&#225;th, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress,+challenges+and+perspectives+on+fish+gamete+cryopreservation:+A+mini-review.">Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review.</a> Gen. Comp. Endocrinol. , (2016).</li><li>Kime, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-assisted+sperm+analysis+(CASA)+as+a+tool+for+monitoring+sperm+quality+in+fish.">Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish.</a> Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 130 (4), 425-433 (2001).</li><li>Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+of+sperm+motility+and+factors+affecting+sperm+quality+in+cultured+fish.">The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish.</a> Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).</li><li>Verstegen, J., Iguer-Ouada, M., Onclin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+assisted+semen+analyzers+in+andrology+research+and+veterinary+practice.">Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice.</a> Theriogenology. 57 (1), 149-179 (2002).</li><li>Magnotti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+vitrification+of+fish+semen:+a+review+with+special+emphasis+on+marine+species.">Cryopreservation and vitrification of fish semen: a review with special emphasis on marine species.</a> Rev. Aquacult. , (2016).</li><li>Dziewulska, K., Rzemieniecki, A., Czerniawski, R., Domaga&#322;a, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-thawed+motility+and+fertility+from+Atlantic+salmon+(Salmo+salar+L.)+sperm+frozen+with+four+cryodiluents+in+straws+or+pellets.">Post-thawed motility and fertility from Atlantic salmon (Salmo salar L.) sperm frozen with four cryodiluents in straws or pellets.</a> Theriogenology. 76 (2), 300-311 (2011).</li><li>Babiak, I., Bolla, S., Ottesen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitable+methods+for+cryopreservation+of+semen+from+Atlantic+halibut,+Hippoglossus+hippoglossus+L.">Suitable methods for cryopreservation of semen from Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L.</a> Aquac. Int. 16 (6), 561-572 (2008).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+eel+(Anguilla+japonica+Temminck+&amp;+Schlegel,+1846)+propagation+using+cryopreserved+sperm+samples.">Japanese eel (Anguilla japonica Temminck &amp; Schlegel, 1846) propagation using cryopreserved sperm samples.</a> J. Appl. Ichthyol. 33 (3), 550-552 (2017).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이 프로토콜 유럽 장 어 성숙, 처리 및 정자 cryopreservation에 대 한 완전 한 프로세스를 설명합니다. 여기에 설명 된 농업 조건 빠른 성숙 및이 종 6,,725에 높은-품질의 높은 볼륨의 생산을 위한 최적의 있습니다. 이 cryopreservation 프로토콜 및 해빙 후 수정에 대 한 그것의 잠재적인 사용의 성공 신선한 정자 26의 품...

지난 25 년 동안 유럽 뱀장어 (앵귈라 앵귈라) 유럽 해 안에 도착의 수는 꾸준히 90 1,2,3감소. 오염, 감염, overfishing, 서식 지 파괴 등이 급격 한 하락을 설명 하는 몇 가지 요인이 있다. 이 모든 중요 한 멸종 위기 4자연 보존 (IUCN) 목록은 국제 연합에 유럽 장 어의 포함에 지도 하는이 종에 깊은 영향을 했다. 따라서, 기술 및 포로에 복제에 대 한 프로토콜의 개발은 필요 합니다.
포로에서 유럽 장 어의 성숙 호르몬 치료 5,,67 에 의해 이루어집니다 하지만 남녀 모두에서 gametes의 생산 8동기화 할 어렵습니다. 새로운 안 드로 겐 임 플 란 트의 개발 oogenesis 뱀장어 9,에 있는 가속을 보이고 있다 하더라도10, 여성에서 마지막 성숙의 타이밍은 여전히 매우 변수 하 고 11를 제어 하기 어려운. 따라서, 기술의 정자 12,,1314 및 cryopreservation 단기 저장 복제 관리, 생식 체 동기화 불필요 한 8를 만들기 위해 필요 하다.
유럽 장 어 정자의 cryopreservation 2003 15,16이후 개발 되었습니다. 몇몇 연구원은 성공적인 프로토콜 cryoprotectants 16,17,18,,1920디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 또는 메탄올을 사용 하 여 설계 되었습니다. 두 프로토콜 성공적으로 사용 되었습니다, 하지만 해 동된 정자 DMSO와 cryopreserved의 얻은 세포 생존 능력에 메탄올 20,21보다 낮은 것입니다. 또한, 장 정자 DMSO와 접촉을 활성화 하 고 더 지루한 정자 조작 19필요 하, 그러므로 메탄올 DMSO 보다 유럽 장 어 정자에 대 한 더 적합 한 cryoprotectant 이다.
여기, 아래 최적의 처리 및 유럽 장 어의 호르몬 치료에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이것 이외에,이 종에서 정자 품질 평가 대 한 프로토콜은 cryoprotectant로 메탄올을 사용 하 여 최고의 유럽 장 어 정자 cryopreservation 프로토콜도 설명 됩니다.

<table><tbody><tr><td>AQUACEN BENZOCA&amp;Iacute;NA +D2A2:D24</td><td>AQUACEN</td><td>3394ESP</td><td>Benzocaine</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Avantor&amp;nbsp;</td><td>3624-19</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD Plastipak</td><td>305501</td><td>Syringe 1 mL</td></tr><tr><td>FC500</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Flow cytometer</td></tr><tr><td>Air pump 100</td><td>EHEIM</td><td>4011708370032</td><td>Modified for suction</td></tr><tr><td>Eppendorf 1.5</td><td>Eppendorf</td><td>175508</td><td>Plastic tubes 1.5 mL</td></tr><tr><td>Falcon tubes</td><td>Falcon</td><td>175747</td><td>Plastic tubes 15 mL</td></tr><tr><td>Flexible bucket</td><td>Fiel</td><td>1040101</td><td>40 L, Black color.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Guinama SL</td><td>Mg96270</td><td></td></tr><tr><td>Cyopreservation straws&amp;nbsp;</td><td>IMV Technologies</td><td>14550</td><td>500 &amp;micro;L straws</td></tr><tr><td>Live/Dead Sperm Viability Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L7011</td><td>Cytometer Kit</td></tr><tr><td>Modelling clay</td><td>JOVI</td><td>Art 30</td><td>4 different colors</td></tr><tr><td>Precision scale PCB</td><td>KERN &amp;amp; Sohn GmbH</td><td>PCB35002</td><td>Digital scale</td></tr><tr><td>Saline solution Vitulia 0.9%</td><td>Laboratorios Ern, S.A.</td><td>C.N. 999790.8</td><td>Saline solution</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Levantina de Lab. SL</td><td>3710025</td><td>30 cm metal forceps</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Levantina de Lab. SL</td><td>3700014</td><td>Scissors 14cm</td></tr><tr><td>Ovitrelle (r-hCG)</td><td>Merck SL</td><td>EMEA/H/C/000320</td><td>Human chorionic gonadotropin</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse 80i</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscope</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Panreac Quimica SAU</td><td>2112211210</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Panreac Quimica SAU</td><td>3257091611</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Panreac Quimica SAU</td><td>1416381210</td><td></td></tr><tr><td>782M Camera</td><td>Proiser</td><td>782M</td><td>Camera for CASA</td></tr><tr><td>ISAS v1</td><td>Proiser</td><td>ISAS v1</td><td>CASA software</td></tr><tr><td>SpermTrack-10</td><td>Proiser</td><td>SpermTrack-10</td><td>Countig chamber for CASA</td></tr><tr><td>Beaker Pyrex 3L</td><td>PYREX</td><td>2110668</td><td>Glass beaker 3L</td></tr><tr><td>Flask Pyrex 250 GL-45</td><td>PYREX</td><td>21801365</td><td>Glass flask 250 mL</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Scharlab SL</td><td>PO02000500</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Scharlab SL</td><td>ME03061000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Scharlab SL</td><td>MA00370500</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05482</td><td>Bovine serum albumina</td></tr><tr><td>Styrofoam box</td><td></td><td></td><td>34x34x30 cm and 5cm thick</td></tr></tbody></table>

handling and treatment of male european eels (anguilla anguilla) for hormonal maturation and sperm cryopreservation

지난 년 동안 여러 연구 그룹 개발 및 유럽 장 어 처리 및 성숙에 대 한 새로운 프로토콜의 개선에 노력 하고있다. 로 서 아직, 인간 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG)의 주간 주사 치료, 몇 주 동안 높은-품질의 높은 볼륨 생산의 단지 5-6 주 후 남성 maturate를 입증 해야 합니다. 또한, 정자 cryopreservation 프로토콜 다른 extender를 사용 하 여, cryoprotectants 및 냉각 시간을 녹고 있다 이전 설명 유럽 장 어에 대 한. 여기, 우리가 보여줍니다 수정 또는 cryopreservation, Tanaka´s 익스텐더 솔루션 직접 사용 될 수 있다 솔루션 및 희석의 다른 종류의 사용을 불필요 한 만들기. 또한, 메탄올의 사용은 cryoprotectant로 만드는이 프로토콜 사용 하기 쉬운 메탄올은 낮은 독성과 정자를 활성화 하지 않습니다. 정자는 cryoprotectant 추가 직후 cryopreserved 필요 하지 않습니다 그리고 그것은 오래 되 고 해 동 후 사용할 수 있습니다. 또한, 정자 운동 성은 비록 그것이 신선한 정자 보다 낮은 녹고 후 여전히 높다입니다. 이 작품의 목표 처리, 성숙 및 정자 cryopreservation 유럽 장 어에 대 한 가장 사용할 수 있는 프로토콜을 표시 하는 것입니다.

70% 이상, 정자 운동 성 가진 18 뱀장어에서 정자는이 연구에 대 한 선정 됐다. 결과 신선한 정자 (표 1 및 그림 2)에서 그에 비해 녹고 후 모든 품질 매개 변수에서 감소를 보였다. 운동 성 결과 (± S.E.M., 의미 n = 18) 총 운동 성 및 진보적인 운동 후 해 동 정자 샘플에서 발견 보다 신선한 정자에 더 높은 총 운동 성 및 진보적인 운동 성을 보였...

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Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

유럽 장 어 성숙 및 정자 cryopreservation 프로토콜 지난 수 년에 걸쳐 개선 되었습니다. 이 문서는 성숙과 메탄올 cryoprotectant로 유도 대 한 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG)을 사용 하 여 사용할 수 있는 최상의 프로토콜을 설명 합니다.

처리와 치료의 남성 유럽 뱀장어 (앵귈라 앵귈라) 호르몬 성숙 및 정자 Cryopreservation

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...

handling-treatment-male-european-eels-anguilla-anguilla-for-hormonal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

7.8K 조회수.  Universitat Politècnica de València. 유럽 장 어 성숙 및 정자 cryopreservation 프로토콜 지난 수 년에 걸쳐 개선 되었습니다. 이 문서는 성숙과 메탄올 cryoprotectant로 유도 대 한 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG)을 사용 하 여 사용할 수 있는 최상의 프로토콜을 설명 합니다.

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Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

조작 및<em&gt; 체외</em의&gt; 성숙<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em세포질 내 정자 주입에 이어&gt; 난 모세포, 배아 발달을 연구하는

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

연구

발생학

Use of a Battery of Chemical and Ecotoxicological Methods for the Assessment of the Efficacy of Wastewater Treatment Processes to Remove Estrogenic Potency

Endocrine Disrupting Compounds pose a substantial risk to the aquatic environment. Ethinylestradiol (EE2) and estrone (E1) have recently been included in a watch list of environmental pollutants under the European Water Framework Directive. Municipal wastewater treatment plants are major contributors to the estrogenic potency of surface waters. Much of the estrogenic potency of wastewater treatment plant (WWTP) effluents can be attributed to the discharge of steroid estrogens including estradiol (E2), EE2 and E1 due to incomplete removal of these substances at the treatment plant. An evaluation of the efficacy of wastewater treatment processes requires the quantitative determination of individual substances most often undertaken using chemical analysis methods. Most frequently used methods include Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GCMS/MS) or Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LCMS/MS) using multiple reaction monitoring (MRM). Although very useful for regulatory purposes, targeted chemical analysis can only provide data on the compounds (and specific metabolites) monitored. Ecotoxicology methods additionally ensure that any by-products produced or unknown estrogenic compounds present are also assessed via measurement of their biological activity. A number of in vitro bioassays including the Yeast Estrogen Screen (YES) are available to measure the estrogenic activity of wastewater samples. Chemical analysis in conjunction with in vivo and in vitro bioassays provides a useful toolbox for assessment of the efficacy and suitability of wastewater treatment processes with respect to estrogenic endocrine disrupting compounds. This paper utilizes a battery of chemical and ecotoxicology tests to assess conventional, advanced and emerging wastewater treatment processes in laboratory and field studies.

Endocrine Disrupting Compounds (EDC) pose a substantial risk to the aquatic environment. Municipal wastewater treatment plants are major contributors to the estrogenic potency of surface waters. The methodology provided in this paper allows for an assessment of the efficacy and suitability of wastewater treatment processes with respect to EDC removal.

폐수 처리 프로세스의 효능의 평가를위한 화학 및 생체 독성 방법의 배터리를 사용하면 에스트로겐 효능을 제거하는 방법

Endocrine Disrupting Compounds pose a substantial risk to the aquatic environment. Ethinylestradiol (EE2) and estrone (E1) have recently been included in ...

환경과학

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

열 충격이 치료와 제브라 피쉬 배아의 배수성 조작

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Implantation of a New Micro Acoustic Tag in Juvenile Pacific Lamprey and American Eel

Juvenile Pacific Lamprey and American eels were used for laboratory evaluations to determine potential effects from tag implantation. Telemetry technology has been identified as a way to obtain more detailed information on movement and behavior across a broader spatial scale than is possible with other known technology. The purpose of this method is to provide a detailed step by step instruction on tag implantation for both lampreys and eel. For laboratory studies using actively migrating juvenile Pacific Lamprey (120-160 mm), we determined that the presence of the tag did not alter the swimming ability between tagged and untagged Individuals or have any significant tag loss (&lt;3%). Similar results were determined during laboratory testing of Yellow phase American Eels (113-175 mm). No mortality occurred during a 38-day holding period and there was minimal tag loss (3.8%). The presence of the tag did not have any significant effect on the swimming ability or survival of tagged eels compared to untagged controls and there was minimal tag loss.

This article illustrates the procedure for implanting a micro acoustic tag in juvenile Pacific Lamprey and American Eel. Our application is based on laboratory trials, which indicate that acoustic tags can be successfully implanted with no apparent effects on swimming ability or survival and minimal tag loss.

청소년 태평양 심고와 미국 장 어에 새로운 마이크로 음향 태그의 주입

Juvenile Pacific Lamprey and American eels were used for laboratory evaluations to determine potential effects from tag implantation. Telemetry technology ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

높은 처리량 Zebrafish의 정자 Cryopreservation에 대한 방법과 체외에서 수정

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

생물학

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

높은 처리량<em&gt; 다니오 레 리오 (rerio)</em&gt; 에너지 지출 분석

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods for safe storage of genetic resources beyond the common practices of keeping breeding colonies. The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Cryopreservation of early-stage germ cells by whole testes NIV offers possibilities for the storage of zebrafish genetic resources, especially since after transplantation they can mature into both male and female gametes. Testes were excised, pinned on an acupuncture needle, equilibrated in two cryoprotective media (equilibration solution containing 1.5 M methanol and 1.5 M propylene glycol; and vitrification solution containing 3 M dimethyl sulfoxide and 3 M propylene glycol) and plunged into liquid nitrogen. Samples were warmed in a series of three consequent warming solutions. The main advantages of this technique are (1) the lack of spermatozoa after digestion of warmed testes thus facilitating downstream manipulations; (2) ultra-rapid cooling enabling the optimal exposure of tissues to liquid nitrogen therefore maximizing the cooling and reducing the required concentration of cryoprotectants, thereby reducing their toxicity; (3) synchronous exposure of several testes to cryoprotectants and liquid nitrogen; and (4) repeatability demonstrated by obtaining viability of above 50% in five different zebrafish strains.

The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Additionally, the repeatability of the method in five different zebrafish strains was tested.

Zebrafish Spermatogonia 전체 Testes 바늘의 cryopreservation 몰입 울트라-빠른 냉각

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems for sperm analysis were developed to measure several parameters and one of the most commonly measured is the sperm motility.
Initially, this computer technology was designed for mammalian species, although it can also be used for fish sperm analysis. Fish have specific features that can affect sperm assessment such as a short motility time after activation and, in some cases, adaptation to lower temperatures. Thus, it is necessary to modify both software and hardware components to make motility analysis more efficient for fish sperm analysis. For mammalian sperm, the heating plate is used to maintain optimal temperatures of spermatozoa. However, for some fish species, it is advantageous to use a lower temperature to prolong the duration of motility, since the sperm remain active for less than 2 min. Therefore, cooling devices are necessary to refrigerate samples at constant temperature over the time of analysis, including on the optical microscope. This protocol describes the analysis of fish sperm motility using software for sperm analysis and new cooling devices to optimize the results.

The present protocol describes a procedure of fish sperm assessment using computer-assisted sperm analysis and cooling devices. The software gives a rapid, accurate and quantitative analysis of fish sperm quality based on spermatozoa motility, which can be a useful tool in aquaculture to improve reproduction success.

생선 정자 평가 소프트웨어를 사용 하 여 및 냉각 장치

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish species is that it possesses interfertile cave and river-dwelling populations. This enables the genetic mapping of heritable traits that were fixed during adaptation to the different environments of these populations. While this species can be maintained and bred in the lab, it is challenging to both obtain embryos during the daytime and create hybrid embryos between strains. In vitro fertilization (IVF) has been used with a variety of different model organisms to successfully and repeatedly breed animals in the lab. In this protocol, we show how, by acclimatizing A. mexicanus to different light cycles coupled with changes in water temperature, we can shift breeding cycles to a chosen time of the day. Subsequently, we show how to identify suitable parental fish, collect healthy gametes from males and females, and produce viable offspring using IVF. This enables related procedures such as the injection of genetic constructs or developmental analysis to occur during normal working hours. Furthermore, this technique can be used to create hybrids between the cave and surface-dwelling populations, and thereby enable the study of the genetic basis of phenotypic adaptations to different environments.

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

In vitro fertilization is a commonly used technique with a variety of model organisms to maintain lab populations and produce synchronized embryos for downstream applications. Here, we present a protocol that implements this technique for different populations of the Mexican tetra fish, Astyanax mexicanus.

아스티야낙스 멕시코의 게임테 컬렉션 및 체외 수정

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish ...

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Japanese medaka (Oryzias latipes) is a teleost fish and&#160;an emerging vertebrate model for ecotoxicology, developmental, genetics, and physiology research. Medaka is also used extensively to investigate vertebrate reproduction, which is an essential biological function as it allows a species to perpetuate. Sperm quality is an important indicator of male fertility and, thus, reproduction success. Techniques for extracting sperm and sperm analysis are well documented for many species, including teleost fish. Collecting sperm is relatively simple in larger fish but can be more complicated in small model fish as they produce less sperm and are more delicate. This article, therefore, describes two methods of sperm collection in the small model fish, Japanese medaka: testes dissection and abdominal massage. This paper demonstrates that both approaches are feasible for medaka and shows that abdominal massage can be performed a repeated number of times as the fish quickly recover from the procedure. This article also describes a protocol for computer-assisted sperm analysis in medaka to objectively assess several important indicators of medaka sperm quality (motility, progressivity, duration of motility, relative concentration). These procedures, specified for this useful small teleost model, will greatly enhance understanding of the environmental, physiological, and genetic factors influencing fertility in vertebrate males.

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

This article describes two quick and efficient methods for collecting sperm from the small model fish medaka (Oryzias latipes), as well as a protocol for reliably assessing sperm quality using computer-assisted sperm analysis (CASA).

Teleost 모델의 정자 수집 및 컴퓨터 보조 정자 분석 일본 메다 카 (Oryzias latipes)

Japanese medaka (Oryzias latipes) is a teleost fish and&#160;an emerging vertebrate model for ecotoxicology, developmental, genetics, and physiology ...