RNA의 100개 이상의 뚜렷한 수정이 있으며, 그 중 3분의 2는 메틸레이션입니다. 이 프로토콜은 RNA 메틸화 라이터 활성에 대한 민감하고 정확한 분석을 위한 방법을 제공한다. 이 사용하기 쉬운 기술은 일반적으로 유물에 수그리는 항체의 사용 없이 메틸화된 RNA를 정량화하고 시각화할 수 있게 합니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원 생인 사만다 셸튼이 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 100 마이크로리터 RNA 메틸 트랜스퍼라아제 분석기를 얼음 에 1.5 밀리리터 튜브에 설정합니다. 튜브를 완전히 혼합하고 원심분리기를 5초 동안 200배 g에서 혼합하여 튜브 의 바닥에서 용액을 수집합니다.
2 시간 동안 37 섭씨에서 튜브를 배양하십시오. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 컬럼 정제를 사용하여 반응을 청소합니다. 액체 신경수 수를 수행하려면 샘플당 1개의 유리병, 백그라운드 측정용 유리병 1개, 스 와이프 테스트를 위한 바이알 1개로 신경 수 랙을 설정합니다.
바이알을 5밀리리터의 신경화 계수 용액으로 채웁니다. 각 용출 된 방사성 RNA 샘플의 10 마이크로 리터를 하나의 유리병에 추가합니다. 뚜껑을 조이고 부드럽게 섞습니다.
스 와이프 테스트 바이알을 준비하려면 절차 중에 사용되는 모든 표면과 장비에 면 봉면을 철저히 문지릅니다. 이러한 면봉을 반짝이는 용액으로 채워진 바이알에 넣고 뚜껑을 조입니다. 신경화 카운터에서 샘플을 실행하려면 카운터 후드를 열고 랙을 기계에 삽입하고 후드를 닫습니다.
단일 랙 카운트를 선택합니다. 사용자 프로그램 선택 선택을 선택합니다. 60초 동안 트리튬을 측정하는 프로그램을 선택하거나 만들고 카운트 랙을 누르세요.
반짝이 수를 세 번 반복합니다. 그 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 우레아 데마포링 폴리아크라이알라미드 젤을 준비하고 다시 실행합니다. 방사성 RNA 물질 20 마이크로리터를 2X 젤 로딩 버퍼 20마이크로리터를 포함하는 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기.
사다리를 준비한 후 샘플을 섭씨 70도에서 15분 동안 배양합니다. 젤 탱크에서 버퍼를 겔의 우물로 피펫팅하여 시료 로딩 하기 직전에 젤의 우물을 다시 한 번 씻으시다. 그런 다음 준비된 사다리 20개, 샘플의 마이크로리터 20개, 1X 젤 로딩 버퍼 20개를 젤 의 차선에 적재합니다.
폴리아크릴아미드 백분율에 따라 60~180분 동안 100볼트에서 젤을 실행합니다. 젤이 실행이 완료되면 카세트에서 젤을 제거하고 초감도 핵산 젤 얼룩 5 마이크로 리터와 함께 1X TBE 버퍼의 50 밀리리터를 포함하는 상자에 놓습니다. RNA를 얼룩지게하기 위해 5 분 동안 로커에 배양하십시오.
그런 다음, 조심스럽게 상자에서 젤을 꺼내, 우물과 왼쪽에 사다리와 젤 이미징 시스템의 UV transilluminator에 배치. 젤에 카메라를 집중하고 UV 광을 켜고 젤 이미지를 찍습니다. 그런 다음 UV 노출을 끄고 이미지를 TIFF 파일로 저장합니다.
젤을 다시 상자에 넣고 TBE를 제거하고 실온에서 로커에 50 밀리리터의 고정 용액으로 젤을 30 분 동안 고정하십시오. 다음으로, 부드럽게 자동 방사선 화 강화 용액의 25 밀리리터를 포함하는 신선한 블랙 박스에 젤을 이동합니다. 실온에서 로커를 30분 동안 배양합니다.
젤을 부드럽게 들어 올리고, 우물과 오른쪽에 사다리가 있는 플라스틱 랩 시트에 얼굴을 아래로 놓습니다. 젤 뒷면에 크로마토그래피 용지 2장을 놓고 전체 스택을 뒤집습니다. 젤 드라이어를 섭씨 80도로 예열합니다.
젤 드라이어의 플라스틱 커버를 다시 이동합니다. 플라스틱 덮개 아래에 전체 스택을 삽입하고 플라스틱 덮개를 다시 아래로 이동하여 씰을 만듭니다. 젤을 섭씨 80도에서 1시간 동안 건조시다.
그런 다음 젤 건조기를 끄고 스택을 부드럽게 제거합니다. 랩과 두 번째 크로마토그래피 용지를 제거합니다. 나머지 크로마토그래피 용지에 말린 젤을 자동 라디오그램 카세트에 테이프로 테이프로 바세요.
어두운 방에 는 사인 라디오 필름 1 장을 추가합니다. 카세트를 음의 섭씨 80도에 저장하고 신호 강도에 따라 적절한 시간에 필름을 개발합니다. 필름이 개발되면 카세트 위에 놓고 실험실 마커를 사용하여 젤의 네 모서리, 각 우물 및 XC 및 BB 염료의 위치를 신중하게 표시합니다.
인치당 300 픽셀 또는 600 픽셀의 해상도로 필름을 스캔하고 이미지를 TIFF 파일로 저장합니다. 본 연구에서는, 항체가 없는 분석이 RNA 메틸트랜스체 활성을 분석하는 것으로 입증된다. 7SK 소형 핵RNA의 T7 RNA 폴리머라제와 함께 체외 전사 반응에서 전형적인 실행은 상대적으로 짧고 고도로 구조화된 RNA를 나타낸다.
7SK보다 짧고 긴 여러 개의 원치 않는 밴드가 있는데, 이는 무작위 전사 개시 또는 종료 이벤트로 인해 발생할 수 있습니다. 이 때문에, 체외 전사 반응에 따른 겔 정제는 깨끗한 RNA 샘플을 얻는 것이 중요하다. 이 시점에서, 관심있는 RNA는 사다리에 상대적인 위치에 의해 식별되고 겔 정화에 의해 정제될 수 있다.
추천 RNA 및 단백질 농도의 하한을 이용한 대표적인 RNA 메틸트랜스퍼라제 분석이 여기에 나와 있다. 이 분석법은 신자극 수의 정량적 결과뿐만 아니라 자동 방사선 사진의 정성적 결과를 모두 허용합니다. 여기서, 메틸레이트 7SK로 알려진 RNA 메틸트랜스퍼라제는 또한 U6를 메틸레이트할 수 있는 것으로 나타났다. 더욱이, 최근 7SK에 대해 나타난 바와 같이, 그의 음색 H4를 MePCE에 결합하는 것도 U6 메틸화를 억제한다.
이는 이 프로토콜의 견고성을 보여주는 신경 수와 자동 라디오그램 모두에서 관찰될 수 있다. RNA는 분해에 취약하므로 RNase 가없는 시약을 사용하고 모든 표면과 장비를 철저히 청소하십시오. 이 메틸트랜스퍼라제 분석에서 얻은 방사성 표지 된 RNA는 전기 이동성 이동 분석에 의한 RNA 디메틸라제 활성 또는 RNA 결합 활성을 평가하기 위해 직접 사용될 수 있다.
이 방법은 연구원이 포인트 돌연변이 및 작은 분자 억제제 처리를 포함하여 RNA 메틸 전달효소 활동에 다른 요인의 효력을 시험할 수 있습니다. 이 방법은 방사성 물질을 사용하므로 적절한 PPE를 착용하고 방사성 물질을 취급하고 폐기하는 동안주의하십시오.
