이 프로토콜은 난소 마이크로 환경의 심층 검사에서 시험관내 검사를 허용합니다. 사용자가 여포 성장 및 개발을 결정할 수 있도록, 뿐만 아니라 스테로이드 발생 및 면역 분자의 풍부. 이 기술의 한 가지 장점은 난소 마이크로 환경과 신흥 여포의 변화를 직접 평가하고 특정 호르몬의 첨가로 인한 독특한 상호 작용을 평가하는 능력입니다.
이 기술은 여포 체포를 일으키는 원인이 되는 생식 무질서의 각종 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다. 예를 들면, 다낭성 난소 증후군. 우리는 직접 시험관 내 난소 마이크로 환경을 평가 할 수 있기 때문에, 절차를 시연브룩 벨, 내 실험실에서 학부 연구원이 될 것입니다.
절제된 턱 집게를 사용하여 난소를 고정하고 반으로 슬라이스하고 외부 조각을 제거하기 시작합니다. 1~2밀리미터 깊이의 표면이 난소에서 절단되어 수질이 수집되지 않도록 보장합니다. 메스로 난소 피질의 3~4개의 얇은 스트립을 자르고 세 번째 PBS 충전 페트리 접시에 스트립을 놓습니다.
스트립을 메스 블레이드로 0.5~1입방밀리미터의 작은 사각형 조각으로 자른다. 페트리 접시 아래에 있는 통치자를 사용하여 조각이 비슷한 크기와 두께를 보장하여 일관된 난소 피질 조각을 만듭니다. 세 가지 PBS 와 항생제 분야 페트리 접시에 난소 피질 조각을 세척하고 곡선 팁 집게를 사용하여 세척 사이에 조각을 이동시하십시오.
LB-15 세차장 시리즈를 통해 피질 조각을 이동하여 최종 LB-15 채워진 페트리 접시에 넣습니다. 뚜껑에 동물 ID와 난소쪽으로 라벨을 붙입니다. 난소 당 4 개의 난소 피질 조각을 수집하고 하루 제로 히스토로지그들을 수정하고 RNA 정화를위한 추가 조각을 동결.
배양에 남은 조직 조각을 사용하십시오. 최종 조직 세척 및 문화 준비를 위한 생물학적 안전 캐비닛을 준비하십시오. 생물 안전 캐비닛에 넣기 전에 70 %의 에탄올로 공급을 소독합니다.
문화를 위한 모든 난소 피질 조각을 생물학적 안전 캐비닛으로 옮기고 LB-15가 채워진 페트리 접시에 다시 한 번 씻으실 수 있습니다. 파이펫 350 마이크로리터 의 웨이머스 배지 24 잘 조직 배양 플레이트에 잘 당. 코팅되지 않은 배양체를 각 우물에 잘 삽입하여 삽입기 의 밑에 거품이 형성되지 않도록 합니다.
메시를 뚫지 않고 각 인서의 메쉬에 네 개의 난소 피질 조각을 정중하고 섬세하게 배치합니다. 이산화탄소5%로 37도에서 조직을 배양합니다. 난소 피질 배양 배지를 7일 동안 매일 변경하여 미리 데워진 Waymouth 배지를 사용하십시오.
중간 크기 변경 중에 집게를 사용하여 삽입물을 웰 밖으로 부드럽게 들어 올리고 배양 된 Waymouth 배지를 0.5 밀리리터 튜브로 수집하십시오. 인서트를 다시 우물에 넣고 삽입의 측면과 우물 사이에 분배하여 350 마이크로리터의 신선한 배양 배지를 추가합니다. 조직 배양에서 수집된 배지를 영하 20도에 보관하십시오.
7일간의 문화 후, 부착된 카메라와 컴퓨터 이미징 소프트웨어 프로그램을 사용하여 해부 현미경을 사용하여 난소 피질 조각을 이미지화합니다. 부인의 용액에서 잘 두 개의 난소 피질 조각을 수정하고 cDNA에 대한 RNA를 얻기 위해 액체 질소의 난소 피질 조각에 플래시 동결. 조직으로 모든 우물에 대한이 단계를 반복한 다음 7 일부터 매체를 수집하고 영하 20도저장하십시오.
난소 피질 조각이 부인의 용액에 약 1.5시간 동안 침지된 상태로 유지한 다음 70%에탄올로 세 번 씻고, 조직을 70%에탄올로 유지하고 용액이 더 이상 노랗지 않을 때까지 매일 치웁힙하게 합니다. 헤마톡클린과 에신 얼룩은 원시 여포, 초기 1차 여포, 1차 여포, 이차 여포 및 개미를 위해 수행되었다. 여포 준비는 여포 신생을 평가하기 위하여 문화 앞에 그리고 다음 문화에 고정된 난소 피질에 실시되었습니다.
콜라겐 증착에 의해 결정된 형태학의 차이는 계단 단계 또는 제어 암종에서 난소 피질에 있는 섬유증을 나타낼 수 있습니다. 제어와 계단 단계 암탕 사이에 채워진 난소 피질 당 피그리리우스 붉은 양성 얼룩의 평균 영역의 비교는 여기에 표시됩니다. 배양 배지의 매일 수집은 다양 한 스테로이드 호르몬 생산을 평가 하기 위해 3 일 동안 풀, 방사선 면역 을 사용 하 여.
스테로이드 대사 산물 및 사이토카인 생산은 또한 문화의 4 일 동안 풀링 각 동물에 대한 하나의 우물에서 난소 피질 배양 배지에서 측정되었다. 조직이 오래 앉을수록 더 열심히 작업할 수 있습니다. 당신은 정확한 컷을 연습해야 할 수도 있습니다.
이 기술은 사이토카인 및 케모킨 생산에 대한 과도한 스테로이드의 효과를 결정하기 위해 과도한 스테로이드 발생을 구출하기 위해 신호 통과 경로에 미치는 영향을 이해하고 난소 조직 내에서 여포 진행 또는 체포에 미치는 영향을 결정하는 데 사용됩니다.
