이 방법은 miRNA가 수박 병 박 접목에서 차가운 스트레스하에서 규제되는 방법과 같은 식물 이식에 스트레스 능력에 대한 miRNA 응답의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 호모와 이성이식을 만드는 것이 매우 효율적이고 재현 가능한 방법이라는 것입니다. 그것은 특정 장비가 필요하지 않으며, 수행하기가 매우 쉽고, 일반적으로 접목의 매우 높은 생존율을 초래합니다.
이 방법을 통해 수박 병 박 접목 시스템에서 차가운 스트레스에 대한 miRNA 반응에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 그것은 또한 지역 및 장거리 miRNA 수송의 메커니즘을 공개하기 위한 그밖 현대 유기체에 적용될 수 있습니다. 접목 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 데모는 매우 중요합니다.
이 단계는 고급 기술이 필요하고 접목 된 식물의 생존의 열쇠입니다. 우선, 58°C의 500 밀리리터 비커에 병에 박진 씨앗을 담급니다. 수온이 섭씨 40도까지 떨어질 때까지 가끔 씨앗을 저어줍니다.
물이 식는 동안, 나일론 가방에 이탄 토양 3킬로그램을 넣고 오토클레이브합니다. 물이 실온에 도달하면 씨앗을 증류수로 2~3회 헹구고 여분의 물을 배출합니다. 어두운 성장 챔버에서 28섭씨에서 씨앗이 거즈 백에 새싹을 넣도록 하십시오.
발아 후, 멸균 토탄 토양으로 가득 플라스틱 냄비에 씨앗을 뿌리. 병 박 모종두가 두 개의 평평한 코틸레던을 개발할 때, 수박 씨앗으로이 과정을 반복하십시오. 성장 챔버에서 병 박과 수박 묘목을 성장.
오후에 하루에 한 번 모종에 물을 넣습니다. 다음으로, 코틸레던 아래 2~3센티미터 의 수박 묘목의 고압을 자른다. 코틸레톤 바로 위에 있는 병 통 묘목의 상단을 잘라냅니다.
그런 다음 이쑤시개를 사용하여 다듬어진 병 통 모종의 상단에 구멍을 만듭니다. 손질된 수박 묘목을 구멍에 삽입하여 이종이식을 만듭니다. 이 후, 이전에 설명된 방법을 사용하여 균형 이식을 준비한다.
첫째, 접목된 모종을 투명 폴리에틸렌 백에 싸서 습도가 상대적으로 높게 유지합니다. 그런 다음 7 일 동안 성장 챔버에서 포장 된 묘목을 유지합니다. 일곱 번째 날 이후에는 가방을 제거하고 식물이 7 일에서 10 일 동안 동일한 조건에서 자랄 수 있도록하십시오.
모종을 두 그룹으로 나눕니다. 제어 묘목을 동일한 환경 조건으로 반환합니다. 차가운 처리된 묘목을 대조군과 동일한 밝은 어두운 조건으로 섭씨 6도로 설정된 성장 챔버에 놓습니다.
48 시간 후, 접목에서 접종과 뿌리 줄기의 샘플을 둡니다. 액체 질소에 즉시 샘플을 동결 하 고 영하 70섭씨에 저장. 냉동 샘플을 액체 질소의 2밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 이송합니다.
각 샘플 튜브에 스테인레스 스틸 비드를 추가하고 조직을 미세 분말에 균질화합니다. 각 이식 조합에 대 한, 10 모종에서 지상 샘플의 동일한 금액을 가지고 10 밀리 리터 원심 분리 튜브에 혼합. 적절한 양의 가미염 시약을 추가합니다.
다음으로, RNA가 없는 DNase를 1시간 동안 섭씨 37도에서 밀리리터당 1~150단위를 추가합니다. 그런 다음 마이크로 모세관 전기 포근 시스템에서 총 RNA 양을 결정합니다. 이 후 라이브러리 정규화 시약 및 어댑터를 해동합니다.
그런 다음 다섯 개의 프라임 및 3 개의 프라임 어댑터로 작은 RNase를 리디게이트하고, 그들을 엘리트하고 정화합니다. 역전사는 제조업체의 지침에 따라 5개의 프라임과 3개의 프라임 리그작은 RNase를 전사합니다. 다음으로 제조업체의 프로토콜에 따라 PCR 증폭을 수행합니다.
그런 다음 미세 칼 전기 전광 시스템을 사용하여 RNA 무결성 수가 7 개 보다 큰지 확인합니다. RNA 무결성 수가 7개 이상인지 확인하기 위해 마이크로모세필리 전기포고시스템에 RNA 라이브러리의 마이크로리터 1개를 적재한다. 마지막으로, 높은 처리량 시퀀싱 기기에 작은 RNA 라이브러리를 서열한다.
이 프로토콜을 사용하여 접목 및 실온 및 냉부 응력 조건에 대한 표현형에 대한 98%의 생존율을 얻었다. 24개의 뉴클레오티드의 sRNA는 온도 처리에 관계없이 모든 접목 조합에서 sRNAs의 가장 큰 클래스를 구성했습니다. 감기 치료의 48 시간 후, 30 및 268 microRNA는 각각 위아래로 조절되었다.
이종 이식에 있는 자손의 잎에서, 반대로, 뿌리 줄기의 잎에서, 31 및 12 microRNA는 각각 위아래로 통제되었습니다. 수박 수박 균질 이식에서, 64 및 83 microRNA는 각각 위아래로 통제되었습니다. 이것은 이종 이식이 microRNA 표현의 심오한 재프로그래밍을 일으키는 원인이 되었다는 것을 보여주었습니다.
이 절차를 시도하는 동안, 딸 줄기의 상대적 크기와 나이를 기억하는 것이 중요하고 자손은 성공적인 접목을 만드는 데 중요합니다. 이 절차에 따라, 접목 시스템에서 lncRNA 및 단백질 및 코딩 시스템의 조절을 조사하기 위해 lncRNA 시퀀싱, 프로테오믹 프로파일링을 같은 다른 방법이 수행될 수 있다. 개발 후, 이 기술은 Cucurbitaceae 및 그 너머에 있는 식물 이식 이점의 메커니즘을 탐구하기 위하여 식물 무생물 내성의 필드에 있는 연구를 위한 도로를 포장했습니다.
구아니딘 염산염으로 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 적절한 예방 조치는 항상 이 절차를 수행해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
