이 방법은 세균성 감염의 병원성 및 독성과 같은 숙주 병원체 상호 작용 분야에서 중요한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 에어로모나스 종 중 독성을 평가하고 Aeromonas 감염의 병인에 대한 우리의 이해에 기여할 수 있다는 것입니다. 약 2, 000 그라피드 성인용 벌레를 멸균 된 물로 씻기 시작합니다.
벌레를 튜브 바닥에 두는 세척을 세 번 반복합니다. 원심 분리 후 벌레는 상체를 제거하고 제거 된 물의 3.5 밀리리터에 벌레를 유지합니다. 고가산나트륨 1밀리리터와 수산화칼륨 0.5 밀리리터를 튜브에 넣습니다.
그런 다음 튜브를 6 분 동안 흔들어 웜 바디를 lyse하십시오. 계란이 방출된 후, 10 밀리리터의 탈온화된 물을 추가하여 리시스를 막습니다. 그런 다음 튜브를 원심 분리하여 계란을 끌어 내리고 가능한 한 많은 상체를 제거합니다.
M9 배지 15밀리리터로 계란을 3회 이상 세척합니다. 달걀을 3.5센티미터 의 접시로 옮기고 하룻밤 동안 섭씨 20도에서 배양하십시오. 이 후 플레이트에서 L1 웜 및 M9 배지의 10 마이크로리터를 제거합니다.
웜을 계산하고 M9 배지에서 L1 웜의 농도를 얻습니다. 파이펫을 사용하면 대장균 OP50 LB 국물의 0.5 밀리리터를 섭취하여 ENGM 플레이트에 퍼집니다. 그런 다음 16 ~18 시간 동안 섭씨 37도에서 접시를 배양합니다.
ENGM을 실온으로 냉각시하십시오. 그런 다음 E.coli OP50을 가진 ENGM 플레이트에 L1 웜을 배양했습니다. 웜이 L4 단계에 도달할 때까지 섭씨 20도에서 배양합니다.
먼저, 텍스트 프로토콜에 따라 4개의 Aeromonas 균주 각각의 단일 콜로니를 선택하고 배양합니다. 그런 다음 세균성 국물의 OD 600 흡광도를 측정하고 흡광도가 2.0과 같을 때까지 조정합니다. 다음 지점및 NGM 플레이트에 각 변형에서 세균 국물의 30 마이크로 리터를 확산.
이전에 준비된 L4 웜을 에어로모나균으로 NGM 플레이트로 임의로 선택하고 전송합니다. 그런 다음 분석이 완료될 때까지 접시를 섭씨 20도에서 배양합니다. 매일 살아있는 벌레를 박테리아가 있는 새로운 NGM 플레이트로 옮기는다.
마지막 벌레가 죽을 때까지 매일 살아있고 죽은 벌레와 센서 웜의 수를 계산합니다. Aeromonas 균주를 배양하고 이전에 설명한 대로 흡수도를 측정한 후 세균국을 3, 500g에서 15분 동안 원심분리합니다. S 배지로 세균국을 조정합니다.
그리고 96 웰 플레이트의 8 개의 우물에 S 배지에 세균 국물의 195 마이크로 리터를 추가합니다. 그들에게 M9 매체와 ENGM 플레이트에서 벌레를 씻어. 그런 다음 웜 용액의 농도를 마이크로리터당 5개의 웜으로 조정합니다.
96웰 플레이트의 각 웰에 웜 용액 5마이크로리터를 추가합니다. 셰이커에 접시를 배양하고 24, 48 및 72 시간에서 살아있는 벌레의 수를 계산합니다. Aeromonas 균주를 배양한 후 텍스트 프로토콜 지점에 따라 흡광도를 조정하고 NGM 플레이트에 세균 국물을 퍼뜨리는 것입니다.
그 후, 각 NGM 플레이트에 50 L4 웜을 전송합니다. 24시간마다 웜을 신선한 NGM 플레이트로 옮길 수 있습니다. 무작위로 10 개의 웜을 선택하고 슬라이드에서 M9 배지에서 2 % 아가로즈 젤로 옮겨.
마지막으로 젤에 커버슬립을 배치하고 카메라가 장착된 형광 현미경에 녹색 형광 단백질 필터로 근육 이미지를 캡처합니다. 이 프로토콜에서 4개의 Aeromonas 균주의 독성을 평가했습니다. Aeromonas 종에 감염된 C.elegans의 생존율은 A.caviae를 사용하여 애사에서 가장 높았으며 A.dhakensis를 사용하여 아세에서 가장 낮았습니다.
액체 독성 분석분석에서 C.elegans의 생존은 A.dhakensis 또는 A.수성 구성증에 감염될 때 현저하게 감소했습니다. 근육 괴사 분석 에서 근육 손상의 정도는 에어로모나종 중 다양. A.caviae는 근육 손상을 가장 적게 일으켰고, A.dhakensis는 가장 근육 손상을 일으켰습니다.
이 비디오에 설명된 방법은 에어로모나종 과 그 내의 독성 다양성을 차별화하는 편리한 방법을 제공합니다. 또한 병원균과 숙주 간의 상호 작용을 연구하는 신뢰할 수 있는 모델이기도 합니다.
