림프종은 조직학적으로 복잡한 종양입니다. 따라서, 다중형형 면역조직화학은 종양세포 및 미세환경에 대한 관심의 마커를 연구하기 위해 종래의 염색체 면역조직화학에 비해 이점을 제공한다. 이 기술은 조직성 림프종 샘플에서 항체 기반 염색의 점수를 표준화할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며, 이는 역사적으로 종양 미세 환경의 복잡성으로 인해 어려움을 겪고 있는 과정이다.
구체적으로, 멀티플렉스형형 면역조직화학 및 스펙트럼 이미징은 단일 슬라이드 내에서 다중 얼룩의 정량적 측정을 가능하게 하여 임상 물질 내의 항원 공동 발현 및 스페이션 관계의 평가를 가능하게 한다. 먼저 전자레인지에 표준 항원 검색 버퍼에 왁싱 및 수화 된 슬라이드를 침지하여 유리 항아리를 절약하고 적절한 전자 레인지에서 열 유발 에피토프 검색을 수행하십시오. 최종 멀티플렉스 서열에서 항체의 위치를 기준으로 마이크로파 스트리핑을 추가로 수행한다.
예를 들어, 제4 항체는 염색하기 전에 마이크로파 스트리핑의 세 가지 추가 라운드가 필요합니다. 스트리핑 공정이 완료된 후, 집게와 내열 장갑을 사용하여 슬라이드를 실온에서 증류수로 이송하여 최소 10분 간 식힙니다. 항원 회수 용액이 냉각되면, 10분 동안 상업용 과록시다제 블록을 통해 조직 과산화증 활성을 차단한 다음 트리스 버퍼링식식염수 또는 TBS, 및 비이온 세제에서 5분간 세척한다.
차단 버퍼에서 10분 배양으로 비특이적 염색을 차단한 다음 실온에서 관심 있는 1차 항체를 30분, TBS-D 버퍼로 35분 세척합니다. 다음으로, 적절한 고추냉이 과록시다제가 실온에서 15분 동안 이차 항체를 공주한 다음, TBS-D 완충제에서 3개의 세척을 시연한 후 적절한 고추냉이 과산화증으로 샘플을 배양한다. 마지막 세척 후, 실온에서 5 분 배양 에 대한 슬라이드에 적절한 티라마이드 기반형 형광 시약을 적용한 다음 3 5 분 TBS-D 세척.
입증된 바와 같이 신선한 항원 검색 용액에서 1차 및 이차 항체를 제거하기 위해 추가 마이크로파 기반 스트리핑을 수행한다. 검색의 끝에서, 증류수에서 슬라이드를 냉각하고 실험실 물티슈티없이 슬라이드의 영역을 건조. 실온에서 10분 동안 dappy로 슬라이드를 인큐베이션한 다음 3개의 TBS-D 세척이 진행됩니다.
그런 다음 조직에 연락하지 않고 실험실 물티슈로 슬라이드를 조심스럽게 건조시키고 이미징에 적합한 마운팅 매체로 샘플을 장착하십시오. 모노플렉스 슬라이드 스캐닝의 경우, 샘플 라벨링에 사용되는 형광류에서 적절한 필터를 선택하고 각 마커와 해당 형광 채널을 검사하여 깨끗한 신호를 얻기 위한 적절한 노출 시간을 식별하고 마커에 대한 가장 강한 신호를 가져야 하는 조직 구성 요소에 초점을 맞춘다. 픽셀 강도의 교차 샘플 비교를 허용하려면 라이브 카메라 설정을 사용하여 라이브 카메라 이미지에 과다 노출된 영역이 없을 때까지 각 개별 채널의 노출 시간을 조정합니다.
모든 슬라이드를 스캔한 경우 시뮬레이션된 밝은 필드 이미지를 획득하여 일반 면역히스토케식 패턴과 시각적으로 비교하고 염색 패턴이 올바른지 확인합니다. 조직 마이크로어레이 슬라이드를 스캔하려면 이미징 시스템에서 조직 마이크로어레이 스캐닝 모드와 적절한 자동 초점 알고리즘을 사용합니다. 전체 조직 섹션 슬라이드의 경우, 가장 대표적인 종양 영역에서 최적의 이미지를 선택하기 위해 자격을 갖춘 병리학자가 슬라이드를 검토하십시오.
분석을 시작하기 전에 종양 마커를 선택하여 분석에 대한 관심 있는 세포를 식별합니다. 병리학자가 이미지를 검토하고 조직 세분화가 필요한지 여부를 결정하십시오. 필요한 경우 세분화를 위해 적절한 제어 영역을 선택하고 이미지 분석 소프트웨어가 해당 영역을 올바르게 식별할 수 있는지 확인합니다.
세포 세분화 후, 병리학자가 세분화 맵을 검토하여 의도된 세분화 접근법의 충실도를 확인하고 개별 이미지를 검토하여 세포 세분화가 적절한지 또는 종양 세포, 스트로마 또는 괴사에 대해 농축된 영역을 선택하기 위해 추가 조직 세분화가 필요한지 여부를 결정하도록 한다. 그런 다음 병리학자와 함께 각 마커에 대한 광학 강도 양성 컷오프 값을 결정하고 적절한 통계 소프트웨어 프로그램에서 히스토그램을 생성하여 세포당 마커 강도의 주파수 분포를 분석한다. 정의된 셀 내에서 관심 있는 특정 마커에 대한 백분율 데이터를 생성하려면 피벗 테이블을 데이터 시트에 삽입하고 합계를 선택하여 단일 관심 마커의 긍정 비율을 계산합니다.
총 수로 나눈 마커 양성 세포의 총 수가 계산됩니다. 결과는 하나의 코어, 또는 하나의 연구 번호를 가진 마커 양성 세포 백분율이다. 숫자 데이터를 생성하려면, 각 코어 또는 연구 수의 각 마커에 대한 정규화 수를 추출하기 위해 샘플 내에서 모든 세포 연구에 관심있는 각 마커의 평균 강도를 가져옵니다.
여기서, c-MYC 및 BCL2 유전자 재배열을 사용한 확산 대형 B 세포 림프종 시료를 위한 대표적인 멀티플렉스 형광 면역히토화학적 이미지가 도시된다. 시뮬레이션된 밝은 필드 면역히스토케스토케컬 이미지는 유사한 종양 마커 염색 패턴을 보여줍니다. 혈관 면역 모세포 T 세포 림프종에서 T 세포 패널에 멀티플렉스 형광 면역 히토화학 적 이미지를 적용하면 종양 샘플의 세포 이질성을 드러낸다.
여기서, 편도선 대조군 샘플의 최적화 및 결과 데이터 분석이 도시된다. 다양한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램은 종양 세포 및 종양 미세 환경에서 마커 발현 및 국소화를 양화하기 위해 혼합 해제 단계 후에 사용될 수 있다. 이 기술은 연구원이 림프종의 단 하나 조직 단면도에 있는 특정 세포 모형 내의 다중 마커의 공동 발현을 공부하는 쪽을 포장합니다.
마이크로 웨이브 단계 동안 열로 인한 부상을 방지하고 갑판에서 수행되는 스캐닝 단계 중 추락 위험을 인식하십시오.
