여기에 제시된 분석서를 사용하여, 독특한 균주가 고립된 로타바이러스 균주 들 사이 표현형의 차이를 평가할 수 있습니다. 특히, 로타바이러스의 소독제 내성 균주의 현상제 변화가 조사된다. 플라크 분석기를 사용하여 명확한 정량적 출력을 달성하기 위해서는 로타바이러스 균주와 혈청의 적절한 조합을 선택하는 것이 중요하며, 로타바이러스는 혈청에 잘 적응된다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 과정 학생인 카도야 성석입니다. 액체 질소 용기에서 MA104 세포주를 포함하는 CryoTube를 제거합니다. CryoTube를 수조에 37°C의 수조에 배치하여 세포를 해동시십시오.
T75 플라스크에 혈청 함유 배지의 20 밀리리터에 셀 서스펜션 1밀리리터를 추가합니다. 인큐베이터에서 플라스크를 섭씨 37도, 2~3일 동안 5%의 CO2로 배양합니다. 세포 단층이 80%의 합류에 도달하면, 상체를 제거하고 1X 덜벡코의 PBS의 5밀리리터로 세포를 두 번 씻으라.
플라스크에 0.05%의 트립신-EDTA의 4밀리리터를 추가하고, 플라스크에서 세포를 분리하기 위해 섭씨 37도에서 배양합니다. 셀 서스펜션을 15 밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리기를 190g에서 5분간 전달합니다. 상체를 버리고 혈청 함유 매체의 1 밀리리터에서 펠렛 세포를 다시 중단합니다.
그런 다음 재중단 된 세포를 배지로 100 배 희석시 희석시. 플라크 분석용 6웰 플레이트의 각 웰에 희석된 셀 서스펜션 3밀리리터를 넣습니다. 세포 결합 분석에 대해 24웰 플레이트의 각 웰에 희석 된 셀 현탁액의 1 밀리리터를 추가합니다.
인큐베이터에서 플레이트를 섭씨 37도, 2~3일 동안 5%CO2 저포화 증기로 배양합니다. 영하 80도에서 섭씨 37도의 수조로 저장에서 혈청없는 매체에 바이러스 서스펜션 1 밀리리터가 들어있는 튜브를 37도의 해동으로 옮기다. 돼지 췌장에서 트립신의 마이크로 리터 당 1 마이크로 그램을 바이러스 현탁액의 1 밀리리터에 추가 한 다음 소용돌이.
바이러스 현탁액을 섭씨 37도, CO2 저평가 증기 5%에서 30분 동안 배양합니다. 활성 바이러스 현탁액을 혈청 이없는 배지로 희석하여 감염또는 MOI의 복합성을 세포당 0.1 pfu로 조정합니다. 세포 도금 후 3일 후에 T75 플라스크에서 MA104 세포에 희석된 바이러스 현탁액1밀리리터를 추가합니다.
1시간마다 37°C의 바이러스로 세포를 배양하고 15분마다 부드럽게 플라스크를 흔들어 보냅니다. 그런 다음 돼지 췌장에서 플라스크에 트립신의 밀리리터 당 4 마이크로 그램을 포함하는 혈청없는 매체의 30 밀리리터를 추가합니다. 플라스크를 섭씨 37도, 저포화 증기 5%로 배양합니다.
감염 후 0, 6, 12, 18, 24 및 36시간 플라스크에서 상체 1밀리리터를 수집하고 파이펫을 사용하여 1.5 밀리리터 유형의 상체를 교체한다. 영하80도에서 15분 이내에 동결 해동 주기를 한 다음, 섭씨 37도의 수조에서 15분간 녹는다. 그런 다음 4섭씨에서 10분 동안 12g, 600g의 튜브원심분리를 합니다.
상체를 수집합니다. 증류된 0.2 미크론 필터로 상체를 필터링하여 세포 분획을 제거합니다. 바이러스 성미를 측정하기 위한 플라크 분석서에 적용할 때까지 상체를 영하 80도에서 보관하십시오.
플라크 분석 작업을 수행할 준비가 되면 수집된 상체가 들어있는 튜브를 섭씨 37도의 수조에 놓습니다. 트립신을 10배 희석 시료 1밀리리터에 넣고 섭씨 37도에서 30분간 배양합니다. 이 30 분 인큐베이션 동안 혈청 함유 매체를 제거 한 후 1X PBS의 2 밀리리터로 6 웰 플레이트에서 MA104 세포를 조심스럽게 씻으면하십시오.
혈청이 없는 배지로 배양된 시료를 직렬적으로 희석한 시료1밀리리터를 각 우물로 접종합니다. 섭씨 37도, CO2 저평가 증기5%에서 90분 동안 플레이트를 배양하고 15분마다 부드럽게 접시를 흔들어 놓습니다. 인큐베이션 후 6웰 플레이트에서 접종을 제거합니다.
트립신의 밀리리터 당 4 마이크로그램을 준비된 매체에 추가합니다. 부드럽게 하지만 즉시 각 잘 아가로즈 젤과 혼합 된 매체의 3 밀리 리터를 추가 합니다. 아가로즈 젤이 실온에서 10분 이상 고화되도록 합니다.
그런 다음 섭씨 37도 및 5% CO2 저포화 증기로 이틀 동안 플레이트를 배양합니다. 다음으로, 각 웰에 1X PBS로 희석된 0.015%의 중립 적색 용액 1밀리리터를 추가하고 동일한 조건으로 배양합니다. 3시간 후에 염료를 제거하고 하루 동안 계속 배양하십시오.
다음 날, 각 우물의 플라크 수를 계산하고 밀리리터 당 pfu를 계산합니다. 플라크 분석 전에 세포 합류를 주의 깊게 확인하여 플라크 번호를 보장합니다. 세포 결합 분석의 경우 돼지 췌장에서 트립신 의 마이크로 리터 당 1 마이크로 그램을 바이러스 현탁액의 1 밀리리터에 추가 한 다음 소용돌이를 추가하십시오.
혈청이 없는 배지로 바이러스 현탁액을 희석하여 MOI를 세포당 하나의 pfu로 조정합니다. 24웰 플레이트에 MA104 셀을 트리스 버퍼식 식염수 1밀리리터로 두 번 세척합니다. 이제 희석 된 바이러스 현탁액의 100 마이크로 리터로 세포를 24 웰 플레이트의 각 우물로 접종합니다.
15분마다 완만한 흔들림으로 90분간 4도에서 접시를 배양합니다. 바이러스 접종을 제거하고 삼중 완충식식염수 1밀리리터로 세포를 두 번 씻으시다. 로타바이러스의 이중 좌초 RNA를 추출하려면 1X PBS의 140마이크로리터와 RNA 추출 버퍼 560마이크로리터를 각각 양호하게 첨가한다.
버퍼의 셀 의 안개가 보이지 않을 때까지 파이펫과 적절하게 섞습니다. 제조업체의 프로토콜에 따르면 이중 좌초 RNA를 회수한 후, RNA를 변성하기 위해 5분간 섭씨 95도의 열 블록에 이중 좌초 RNA 추출물을 함유한 1.5 밀리리터 튜브를 배치합니다. 그런 다음 즉시 튜브를 얼음에 놓고 2 분 이상 배양합니다.
역전사 키트를 사용하여 cDNA를 합성합니다. 반응 혼합물의 16 마이크로 리터를 포함하는 PCR 튜브에 변성 바이러스 RNA 용액의 네 마이크로 리터를 추가하고 거품을 생성하지 않도록 파이펫과 신중하게 혼합. 튜브를 회전한 후 열순환기로 역 전사를 수행합니다.
정량적 PCR의 경우, 로타바이러스의 NSP3 게놈 세그먼트의 963 에서 1, 049 영역을 대상으로 하는 담종 삽입 프로브를 사용한다. PCR 급 물로 표준 플라스미드를 직렬로 희석하고 양적 PCR에 대한 마스터 믹스를 진행합니다. 마스터 믹스 20마이크로리터를 96웰 PCR 플레이트의 웰에 넣습니다.
그런 다음 10배 의 파이프팅을 통해 cDNA 샘플 5개 또는 표준 플라스미드의 5개의 마이크로리터를 혼합합니다. 텍스트 프로토콜의 조건에 따라 정량적 PCR을 수행합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 MA104 세포 표면에 결합된 로타바이러스 게놈을 계산한다.
여기에 로타바이러스의 성장 곡선이 표시됩니다. 수정된 곰퍼츠 모델에 가장 적은 제곱 방법을 적용함으로써, 특정 성장률은 0.197로 추정되며, 지연 기간은 6.61시간으로 추정된다. 초기 티터에 고정 된 단계에서 상대 바이러스 티터는 3.15입니다.
6개의 테스트된 로타바이러스 클론 중, 특정 성장률의 추정값은 0.19에서 0.27사이입니다. 모델 피팅의 결정 값 계수가 0.98 이상이기 때문에 이러한 예상 값은 신뢰할 수 있습니다. 세포 결합 분석의 결과는 결합 효율로 표시되며, 이는 비큐어에 존재하는 것과 결합된 바이러스 입자의 비율입니다.
세포 표면에 결합하는 당사의 RV 비온은 세포 결합 분석에 24웰 플레이트를 사용할 때 약 1%의 결합 효율을 가진 밀리리터 당 약 10, 000 개의 사본입니다. 재배 된 세포는 물리적 인 스트레스에 민감하기 때문에 완충제와 한천을 부드럽고 빠르게 부어 주십시오. 본질적으로 바이러스에 대한 새로운 시스템이 도입되었습니다.
이 시스템을 사용하여, 우리는 실제 세포 결합 능력과 계측기와 특정 성장 속도를 평가할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 현상 특성을 측정하는 데 유리합니다. 새로 출현하는 균주의 다른 것을 확인함으로써 바이러스에 대한 새로운 백신을 평가하는 데 도움을 줄 수 있습니다.
바이러스는 BSL-2 병원체로 지정되므로이 절차를 수행하기 위해 BSL-2 실험실을 준비해야합니다.
