이 전 생체 내 공동 배양 시스템은 인간 신경 교종 세포 이동의 새로운 세포 및 분자 메커니즘을 식별하는 데 사용할 수 있으며 잠재적으로 체외 약물 효능 테스트에 사용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인간 교모 세포세포와 축축 간의 상호 작용을 실시간으로 연구하는 능력입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 존 제페키 (John Zepecki)가 될 것입니다.
구획 배양 접시를 조립하려면 콜라겐 스톡 솔루션을 멸균 증류수에 밀리리터당 500 마이크로그램으로 희석하고 철저히 섞습니다. 멸균 이송 파이펫을 사용하면 35mm 배양 접시에 희석된 콜라겐 용액 2밀리리터를 채웁니다. 그런 다음 접시를 약간 기울이고 콜라겐의 얇은 필름을 남겨 두는 용액을 제거합니다.
다음 35밀리미터 접시에 용액을 분배합니다. 이 과정을 반복하여 모든 요리가 코팅될 때까지 필요에 따라 더 많은 콜라겐 솔루션을 추가합니다. 콜라겐을 중합하려면 라미나르 플로우 후드에서 농축 암모늄 수산화효소 3밀리리터가 있는 습식 거즈 패드를 15분 동안 덮습니다.
거즈 패드를 제거하고 35밀리미터 의 접시가 건조되도록 하십시오. 다음으로 금속 파일을 사용하여 18 게이지 바늘의 점을 파일로 만들어 무딘 팁을 만듭니다. 바늘을 70% 에탄올에 담그고 살균합니다.
구획 챔버의 바닥에 실리콘 그리스를 적용합니다. 그리스가 깔끔하게 배치되고 모든 모서리에 겹치는지 확인합니다. 이 기술은 매우 어려울 수 있으므로 우수한 성장을 보장하기 위해 구획 챔버를 설정하기 전에 정확한 양의 그리스를 적용하는 연습을 하는 데 시간이 더 걸릴 것이 좋습니다.
천천히 일하는 것도 매우 중요합니다. 뭔가 잘못되면 엑스트라가 있도록 당신이 필요로하는 생각보다 더 많은 챔버를 설정합니다. 35mm 접시에서 뚜껑을 제거하고 접시를 반전시키고 긁힌 자국을 챔버 위에 놓습니다.
접시 바닥을 집게한 후 부드럽게 누릅니다. 접시에 그리스 챔버를 적용 할 때, 너무 열심히 누르지 마십시오. 그렇지 않으면 축축은 인접한 챔버로 밑으로 자랄 수 없습니다.
용혈성 집게를 사용하여 접시를 부드럽게 뒤집습니다. 집게를 놓습니다. 중앙 구획 의 바닥에 기름의 마운드를 놓습니다.
각 챔버를 보충된 신경 기저 배지로 채웁니다. 필요에 따라 실리콘 그리스로 누출 및 밀봉 누출을 확인하십시오. 모든 문화 요리를 계속 조립하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 하룻밤 을 보관하십시오.
구획 챔버는 동일한 플레이트에 있는 두 개의 우물 사이의 결과를 비교하고 대조하는 능력뿐만 아니라 다른 약리학적 시약을 사용할 수 있습니다. GBM 신경구를 포함하는 준비된 배양을 시드하기 위하여는, 먼저 각 단면 구획챔버에 10%의 FBS를 포함하는 보충된 NBF로 매체를 대체합니다. 다음으로, P20 파이펫을 10 마이크로리터로 설정하면 문화 접시에서 GBM 신경권 1개를 뽑습니다.
축삭을 건드리지 않고 중앙 챔버에 가장 가까운 말단 챔버에 파이펫의 끝을 놓고 GBM 신경구를 천천히 추방하여 축삭에 부드럽게 떨어집니다. GBM 신경구가 부착할 수 있도록 실온에서 1시간 동안 생물안전 캐비닛에 배양을 둡니다. 이 방법은 뇌종양의 치료를 위한 약리학적 화합물을 테스트하는 데 사용될 수 있다.
이 방법은 또한 신경 병증 및 다발성 경화증과 같은 말초 및 중추 신경계의 그밖 질병에 적용될 수 있었습니다. 이 프로토콜에서, 정제된 DRG 축축은 적색 종양 마커 GFAP에 의해 표시된 축산 네트워크 내에 통합된 이중 양성 GFAP 및 KI67 종양 과 유사한 구조물을 형성하는 HCC로 시드되었으며, 개별 HG는 녹색 형광 단백질을 발현하는 동안 혼합또는 축축사이로 이동하였다. 골수성 DRG 올리고덴드로시테 공동 배양에 HG를 첨가하면 HG가 적색 염색 된 골수염 축삭과 관련하여 이동하여 의사 포디아의 형성을 통해 종양 질량에서 멀리 이동하는 것으로 나타났다.
이 기술이 완성되면, 우리는 실시간으로 인간 GBM 줄기 세포의 이동을 연구하는 데 활용할 수 있었다. 우리는 또한 새로운 치료 소 분자 억제제의 추가 후에 세포 이동에 영향을 공부할 수 있었습니다. 골수성 올리고드로시테 DRG 축삭 문화를 침범하는 GBM 구가 여기에 표시됩니다.
여기에 설명된 프로토콜은 새로운 약물 치료의 효과를 평가하기 위해 설계된 다른 생체 모방 3 차원 ex vivo 시스템의 기초가 될 수 있습니다. 사람이 파생 된 세포를 처리 할 때 항상주의를 기울여야합니다. 적절한 PPE를 착용해야하며 혈액 성 병원체 훈련이 완료되어야하므로 환자 파생 조직으로 작업할 위험을 이해해야합니다.
암모늄 수산화는 주의해야하며 장갑, 실험실 코트를 착용하고이 화학 물질에 노출되지 않도록 후드에서 작동해야합니다.
