이 방법은 생체 내 세포하 현미경을 사용하여 살아있는 동물에서 호중구 이동 중 막 리모델링을 연구하는 기술을 설명합니다. 이 프로토콜은 물리적 조건에서 동물이 이동하는 동안 막 역학을 연구하고 조직 미세환경을 포함하지 않는 고유한 접근 방식을 제공합니다. 이 기술은 다양한 세포 유형 및 이동 세포에서 막 재모델링 및 세포골격 동적 장기 재배치 및 막 이동을 해결하기 위해 맞춤화할 수 있습니다.
먼저, 야생형 마우스에서 정제한 호중구 현탁액에 녹색 형광 염료를 첨가하고 1.5ml의 BSA 코팅 튜브에 넣습니다. 튜브 로테이터에서 부드럽게 교반하면서 실온에서 30분 동안 배양합니다. HBSS를 사용하여 3회 세척한 다음 실온에서 400배 G로 5분 동안 원심분리하고 펠릿을 1밀리리터의 Hanks'Balanced Salt Solution에 재현탁시킵니다.
이 현탁액을 BSA 코팅 튜브의 튜브 로테이터에 넣고 주입 절차까지 부드럽게 교반합니다. 주입하기 전에, 20 마이크로리터 당 2백만에서 5백만 세포의 조밀도를 도달하기 위하여 세포 펠릿을 식염수 속에 다시 현탁시키십시오. 마취된 동물을 체온을 유지하기 위해 섭씨 37도의 보온 패드로 옮깁니다.
발 철수 반사를 테스트한 후 미세 트리머를 사용하여 귀에서 털을 제거하여 이미지 품질을 최적화합니다. 동물을 옆으로 눕히고 귀 가장자리를 잡고 수술용 테이프를 사용하여 보온 패드를 따라 평평하게 한 다음 33 게이지 바늘이 장착된 주사기에 호중구 현탁액을 채우고 미세 매니퓰레이터에 장착합니다. 바늘을 귀 쪽으로 부드럽게 움직여 천천히 피부를 뚫습니다.
바늘이 피부 안쪽에 들어가면 피스톤을 천천히 밀어 넣고 2-3 마이크로 리터의 세포 현탁액을 전달합니다. 귀의 2-3 개 다른 부위에 조심스럽게 주사를 반복 한 후 수술 테이프를 조심스럽게 제거하고 동물이 감독하에 의식을 회복하도록하십시오. 조직과 세포가 주사 절차에서 회복될 수 있도록 이미징하기 전에 동물을 1시간 동안 쉬게 하십시오.
현미경이 켜져 있고 stage와 렌즈가 s를 섭씨 37도로 예열한 후 마취된 동물을 현미경 s에 놓습니다.tag이자형. 유리로 된 커버슬립으로 스테이지의 구멍을 덮습니다. 마취된 동물을 조심스럽게 무대 위로 옮깁니다.
한 시간 이상 영상 촬영이 계획된 경우 안과 연고를 바르고 날개 달린 주입 기반 관류 시스템을 고정합니다. 커버슬립 중앙에 식염수 한 방울을 떨어뜨리고 그 위에 호중구 주입 귀를 놓습니다. 커버슬립 중앙을 가로질러 멸균 면봉을 사용하여 귀를 부드럽게 평평하게 펴서 공기 주머니를 제거합니다.
동물의 머리에 가까운 귀 옆으로 나무 막대기를 부드럽게 누르고 테이프로 잠궈 귀를 고정합니다. 그런 다음 현미경 접안렌즈를 사용하여 관심 영역을 찾고 다광자 획득 모드로 전환합니다. 레이저 여기 파장을 900 - 930 나노미터로 설정하여 녹색 형광 염료, mTomato, collagen-I를 동시에 획득할 수 있습니다.
그런 다음 방출된 빛을 수집하기 위해 감지기에서 적절한 미러 세트와 필터 조합을 설정합니다. 하드웨어 구성에 가장 적합한 설정을 결정합니다. 이동하는 세포를 30초에서 1분 간격으로 추적할 수 있더라도 최소 10초 미만의 더 빠른 속도로 세포 내 이벤트를 이미징합니다.
기존의 생체 내 현미경 접근 방식에서는 30X 렌즈와 이미지 크기가 512 x 512 픽셀인 Galvo 스캐너를 사용하여 세포 이동을 추적하고 숙주 마우스 조직을 조사한 다음 2마이크로미터의 단계 크기를 가진 전동 스테이지를 사용하여 Z축 변위를 설정하여 30초마다 30마이크로미터 깊이의 부피를 이미징할 수 있습니다. intravital subcellular microscopy 접근 방식에서는 40X 렌즈와 3배 평균을 내는 공명 스캐너를 사용하여 더 높은 배율과 해상도로 매우 동적인 멤브레인 리모델링을 이미지화합니다. 또한 단계 크기가 1마이크로미터인 피에조를 사용하여 Z축 변위를 설정하여 4-5초마다 20마이크로미터 깊이의 볼륨 이미징을 허용합니다.
10초 동안 20 x 20마이크로미터의 좁은 영역에 고출력 여기 레이저를 집중시켜 호중구 이동을 유발하는 멸균 레이저 손상을 유도합니다. 모든 채널에서 나타나는 강력한 자가형광 신호와 그에 따른 콜라겐 배열의 변화로 인해 레이저로 인한 부상을 식별합니다. 추가 분석을 위해 실험이 끝날 때 데이터를 저장합니다.
수용 마우스는 생체 내 현미경 기반 접근 방식을 통해 혈관, 거주 세포 및 모낭과 같은 귀 조직의 구조적 특징을 시각화할 수 있었습니다. 레이저로 인한 부상은 모든 채널에서 감지된 강력한 자가형광과 콜라겐 배열의 변화로 인해 쉽게 시각화되었습니다. 피부의 3차원 구조와 주입된 호중구의 국소화에 대한 완전한 보기는 3차원 볼륨 렌더링에서 외부 층에서 내부 층까지 피부의 Z 스택을 묘사합니다.
타임랩스 이미징은 호중구가 귀 피부를 샘플링하고 세포 내 기질 및 숙주 조직과 상호 작용하는 것을 보여주었습니다. intravital subcellular microscopy를 사용하여 이동 중 원형질막의 동적 리모델링, 앞쪽 가장자리의 막 돌출부 형성 및 세포 뒤쪽의 수축을 명확하게 시각화합니다. 타임랩스 염기서열은 세포 내 기질과의 상호 작용의 복잡성을 보여줍니다.
원형질막의 국소 역학은 세포 표면의 기저에 있는 100개의 경계 지점 식별을 기반으로 하는 알고리즘 파이프라인을 사용하여 분석되었습니다. 원형질막 돌출부에 의해 밑줄이 그어진 영역과 국소 곡률의 변화는 각 경계점에 대해 계산되었고, 각 시간대에 대해 카이모그래프로 보고되었습니다. 셀의 앞면과 뒷면 모두 셀의 측면보다 더 높은 곡률을 유지합니다.
음의 영역 변화는 양의 영역 변화가 더 두드러지는 선행 가장자리보다 셀의 뒤쪽에서 더 뚜렷합니다. 이미징 후 조직을 수집, 고정 및 염색을 위해 처리하여 관심 대상을 추가로 평가하고 메커니즘을 규명할 수 있습니다. 멤브레인 역학을 이미지화하도록 설계된 이 절차는 다양한 세포 유형과 각각의 환경에서 세포를 이동하는 데 있어 더 광범위한 세포 생물학 문제를 해결하도록 조정할 수 있습니다.
