이 MLB 기형 프로토콜은 국제적으로 중요한 물고기 병원성 박테리아인 Yersinia ruckeri의 역학 및 글로벌 인구 구조에 대한 우리의 이해를 크게 증가시켰습니다. 이전에 설립 된 Yersinia ruckeri 타이핑 계획에 비해, 그것은 매우 높은 변형 해상도를 제공합니다. 절차는 간단하고 저렴하며 실험실 에서 쉽게 비교할 수있는 휴대용 결과를 수여합니다.
이 기술은 진단 특이성을 크게 향상시키고 감염 추적을 가능하게 합니다. 예를 들어, 우리는 이제 종종 비 악성 환경 균주를 배경으로 존재하는 악성 Yersinia ruckeri 클론을 구별 할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 기술자 인 사이마 나스린 모하마드가 될 것입니다.
먼저 멸균 접종 루프를 사용하여 페트리 요리에 적합한 한천 타입에 예르시니아 루케리 순수 문화를 뿌리는 다. 섭씨 22도에서 1~2일 또는 섭씨 15도에서 3~4일 동안 배양합니다. 그 후, 접종 루프를 사용하여 각 페트리 접시에서 하나의 대표 식민지를 선택하고 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 전송하여 50 마이크로리터의 초정화수를 포함하고 재일시 중단한다.
소용돌이는 섭씨 100도의 난방 블록에서 7 분 동안 짧게 배양하십시오. 그런 다음 16, 000 g에서 3 분 동안 원심 분리기를 사용하고 파이펫을 사용하여 상피 템플릿 DNA를 빈 1.5 밀리리터 원심 분리 튜브로 조심스럽게 전송합니다. 다음 단계로 진행하거나 DNA를 섭씨 20도에 저장하십시오.
마스터 믹스를 준비하기 위해 먼저 분석할 세균 샘플 수에 따라 시약 볼륨을 계산하고, 또한 원고에 자세히 설명된 바와 같이 하나의 음수 및 1개의 양수 제어 및 최종 10%의 잉여 부피를 고려한다. 다른 프라이머 농도가 사용됩니다. 두 개의 별도 원심 분리 튜브, PCR 분석 당 하나, 멀티 플렉스 PCR 플러스 마스터 믹스를 추가, 프라이머, 그리고 RNase 무료 물.
준비된 마스터가 저속으로 부드럽게 혼합된 다음 각 마스터 믹스의 22마이크로리터를 PCR 스트립이나 플레이트의 개별 우물에 별도로 분배합니다. 그런 다음, 준비된 DNA 템플릿의 3개의 마이크로리터를 각 우물에 마스터 믹스를 함유하고 있습니다.박테리아 샘플당 2개의 우물, 각 분석에 대해 하나씩 첨가합니다. 확인된 Yersinia ruckeri 균주에서 DNA를 사용하여 양수 제어를 위해, 그리고 음의 제어를 위해 매우 정제된 물을 사용하십시오.
밀봉 및 원심분리기. 준비된 반응을 PCR 열 순환기위에 로드하고 원고에 따라 프로그램을 설정합니다. 이 프로그램은 3시간 이내에 완료됩니다.
제조업체의 권장 사항에 따르면, 1회 TBE 버퍼에 아가로즈 젤 파우더를 추가하여 1.5 중량/볼륨 퍼센트에 도달하고 열을 녹입니다. 주조 에 앞서, 흐르는 물 에서 용존 젤 용액을 잠시 식히고, 젤 용액 50 마이크로리터 당 5 마이크로리터의 형광 핵산 염료를 넣고 혼합하십시오. 캐스팅 트레이를 어셈블하고 수평합니다.
샘플 수에 적합한 원콘을 추가합니다. 젤 용액을 캐스트에 붓고 응고될 때까지 기다립니다. 그 후, 젤 전기포고증 시스템에서 젤을 1회 TBE 버퍼로 포함하는 캐스트를 침수한다.
PCR 제품의 마이크로리터 5개와 새로운 PCR 스트립에 염색제 를 적재하는 마이크로리터 2개를 혼합합니다. 혼합물의 5마이크로리터를 젤의 우물로 옮기. 적어도 하나 이상 잘 비어 저장합니다.
참조를 위해 빈 우물에 DNA 사다리의 5 마이크로 리터를 추가합니다. 전극을 연결하고 젤을 15센티미터당 110볼트로 약 1시간 동안 실행합니다. UV 기반 젤 이미징 시스템을 사용하여 PRC 앰플리콘을 나타내는 여러 대역의 존재를 확인합니다.
PCR 앰플리콘의 확인에 따라, 새로운 PCR 스트립 또는 플레이트를 사용하여 정제된 물에 1~10개의 PCR 제품을 희석시 보냅니다. 소용돌이와 원심분리기는 간단히 말했습니다. 연기 찬장에서 작업하는 동안 포르마이드 및 기준 크기의 표준 솔루션으로 구성된 원심분리기 튜브에서 마스터 믹스를 준비합니다.
분석할 PCR 제품의 수에 따라 원고에 상세한 대로 시약량을 사용하십시오. 10%의 잉여 볼륨을 허용합니다. 소용돌이는 9.5 마이크로리터를 사용 가능한 모세관 전기포레시스 시스템에 적합한 PCR 플레이트에 개별 우물에 간단히 분배합니다.
그런 다음 희석 된 PCR 제품의 0.5 마이크로 리터를 추가하십시오. 밀봉 및 원심분리기. 그런 다음 샘플을 포함하는 플레이트를 PCR 열 사이클러에 넣고 샘플을 섭씨 95도에서 3분간 분해한 후 섭씨 4도까지 무기한 냉각합니다.
원심분리기는 1분 동안 1000g의 원심분리기를 조심스럽게 제거하고 제조업체의 지시에 따라 보정된 모세관 전기포아 시스템에 플레이트를 적재합니다. 선택 장치에 적합한 시약을 사용하여 단편 분석 모세관 전기 포근을 실행하고 원고의 설명에 따라 실행 조건을 조정합니다. Yersinia ruckeri VNTR 모세관 전기 포근 크기 호출의 경우, 먼저 모세관 전기 포근 결과 파일을 유전자 매퍼 5 소프트웨어로 가져옵니다.
분석 방법을 마이크로위성 기본값으로 설정하고 크기 표준에 따라 적절한 제품 선택을 선택한 다음 분석 버튼을 누릅니다. 크기 일치 편집기를 통해 크기 표준 조각의 올바른 식별을 확인하고 눈에 띄게 잘못된 할당을 수정합니다. 그런 다음 읽을 샘플을 선택하고, 디스플레이 플롯 버튼을 누르고, 컨트롤 A를 눌러 크기 조정 테이블의 보기를 활성화합니다.
상단 패널에있는 동안, VNTR 앰플리콘을 나타내는 다섯 피크를 클릭하면서 제어를 누른다. 제어 G를 눌러 크기 조정 테이블을 필터링하여 강조 표시된 다섯 개의 피크의 특성만 표시하고 다운스트림 응용 프로그램에 대한 각 VNTR 궤적의 크기 호출을 기록합니다. 모세관 전기포진 시 편향된 앰플리코 이동성 패턴을 고려하기 위해, 메뚜기 특이적 변수와 함께 획득된 크기 호출을 사용하여 정확한 VNTR 반복 수를 계산한다.
수식은 자동화를 위한 스프레드시트 템플릿에서 구현될 수 있습니다. 스프레드시트에서 원형 계산된 VNRT 반복은 다운스트림 분석 전에 가장 가까운 정수로 계산됩니다. BioNumerics 소프트웨어에서 새 데이터베이스를 만들고 MLVA 플러그인을 활성화하도록 선택합니다.
실험 유형 패널에서 새 실험 유형 만들기를 누르고 문자 유형을 선택하고 요청시 기본 설정을 사용합니다. 그런 다음 새 실험을 선택하고 값 범위로 0에서 100을 사용하여 10 VNTR loci 각각에 대해 새 문자를 추가합니다. 메인 패널로 돌아가면 가져오기 필드와 문자를 선택하여 Yersinia ruckeri VNTR 반복 카운트 및 메서드 데이터를 가져옵니다.
이 파일이 저장되는 파일을 찾아 대상 유형 열에서 선택합니다. VNTRs의 경우 기타 메타데이터가 항목 정보 필드로 분류되는 동안 적절한 문자 값을 선택하는 것을 의미합니다. 나중에 프로세스를 용이하게 하기 위해 선택한 것이 템플릿으로 저장될 수 있습니다.
MST 클러스터 분석을 위해 수행된 가져온 샘플을 선택한 다음 비교 패널에서 새 비교 만들기 단추를 클릭합니다. MST의 시각적 프레젠테이션을 원하는 경우 특정 메타데이터 기능에 따라 예: 컬러 그룹에 샘플을 할당합니다. 그런 다음 범주형 데이터에 대한 고급 클러스터 분석 및 MST를 선택하여 선택한 샘플을 기반으로 MST 다이어그램을 생성합니다.
파티션 매개 변수, 교차 길이, 노드 분기 레이블 지정 등을 추가하여 MST의 시각적 프레젠테이션을 추가로 수정합니다. 필요한 경우 내보내기 이미지 선택을 사용하여 최종 MST를 원하는 형식으로 내보냅니다. 멀티플렉스 PCR에 이어, 젤 전기전경 이미지는 샘플을 포함하는 모든 12차선에 여러 앰플리턴의 존재를 확인하며, 첫 번째 차선은 DNA 사다리를 나타내고 있습니다.
모세관 전기 포근에서 유래된 전기페로그램에서, 다른 VNTR loci는 크기와 염료 라벨링의 조합에 따라 규명될 수 있다. 주황색 피크는 채택된 크기 표준을 나타냅니다. 예시니아 루커리에서 MLVA 프로파일을 기반으로 한 최소 스패닝 트리가 5개의 노르웨이 농장에서 대서양 연어에서 회수된 분리된 사례가 표시됩니다.
팜 원점에서 연결된 명확한 클러스터링 경향을 관찰할 수 있습니다. 예를 들어, 어종의 지리적 지역에서 지배하는 다른 예르티니아 루테리 클론의 MLVA에 의한 식별은 이미 이 병원체에 대한 예방 접종 전략을 개선하기 위해 악용되었습니다.
