이 기술은 신속하고 높은 처리량 분자 기반 기술을 사용하여 매우 유사한 균주의 혼합 인구로부터 미생물의 정확하고 정확한 정량화를 가능하게합니다. 궁극적으로, 균주 사이 를 만들 수 있는 피트 니스의 비교를 가능하게. 단일 풀에서 많은 균주를 동시에 평가하는 능력은 모든 균주가 정확하게 동일한 조건에 노출되기 때문에 잘- 잘 또는 유기체 대 유기체 가변성을 실질적으로 감소시킵니다.
이 기술의 적응성은 거의 모든 유전적 가단 성 유기체와 미생물의 정확한 정량화를 필요로하는 거의 모든 실험 설계에 사용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이, 세균성 염색체에 유전 마커의 공학으로 이 절차를 시작합니다. 하나를 제외한 모든 바코드가 포함된 유전체 DNA 풀을 만듭니다.
이 풀을 희석제로 사용하여 남은 단일 바코드를 포함하는 게놈 DNA가 있는 희석 계열을 수행합니다. 프로브 기반 화학을 위해 설계된 디지털 PCR 슈퍼믹스를 사용하기 위한 제조업체의 권장 사항에 따라 디지털 PCR에 대한 반응을 중복으로 준비합니다. 풀이 된 게놈 DNA를 템플릿 DNA로 사용합니다.
또한 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 20 X 프라이머 프로브 마스터 믹스를 추가합니다. 제조업체의 권장 사항에 따라 디지털 PCR에 대한 복제 제어 반응을 준비합니다. 각 프로브 믹스에 대한 제어 반응은 템플릿 컨트롤 없음, 음수 컨트롤 및 양수 컨트롤로 구성되어야 합니다.
각 바코드 게놈 DNA 샘플에 대한 디지털 PCR 반응을 생성하려면 이러한 단계를 반복합니다. 제조업체의 지침에 따라 액적 발생기를 사용하여 각 반응 조건에 대해 물방울을 생성합니다. 새로 만든 액적을 적절한 96 웰 플레이트로 옮기.
5~50마이크로리터 멀티 채널 파이펫에 200개의 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하십시오. 모든 액적이 생성되고 옮겨진 후 호일 플레이트 실러로 플레이트를 밀봉하십시오. 제조업체권장 열 사이클러를 사용하여 사이클링 조건을 수행하십시오.
써모사이클링이 수행되는 동안 사용된 샘플 이름, 실험 유형 및 슈퍼믹스와 같은 플레이트 설정 정보와 함께 데이터 분석 소프트웨어를 프로그래밍합니다. 대상 1 이름과 대상 1 유형뿐만 아니라 대상 2 이름과 대상 2 유형도 포함됩니다. 써모 사이클링이 완료되면 제조업체의 지침에 따라 완성 된 반응을 물방울 판독기에게 전송하고 읽기 프로세스를 시작합니다.
모든 우물을 읽고 실행이 완료되면 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 QLP 데이터 파일을 엽니다. 동일한 프라이머 프로브 마스터믹스를 사용하는 모든 웰을 선택합니다. 물방울 탭에서 양수 및 음수 방울을 포함하여 각 우물에서 분석된 액적 수를 검사합니다.
총 물방울이 10, 000 미만인 우물은 분석에서 제외됩니다. 1D 진폭 탭으로 이동하고 양수 및 음수 방울의 진폭을 검사합니다. 2개의 고유한 인구로 구성되어 있는지 확인합니다.
소프트웨어 내에서 임계값 을 사용하여 사용된 각 프로브에 대해 양수 및 음수 액적 간에 구분합니다. 모든 우물에 적절한 임계값이 적용되면 소프트웨어는 각 반응에서 DNA 사본 수를 계산합니다. 추가 분석을 용이하게 하기 위해 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.
이러한 값을 사용하여 샘플의 각 고유 유전체 바코드의 초기 복사 수를 계산합니다. 음의 대조군 반응에서 평균 거짓 긍정 비율을 결정하고 실험 반응에서 얻은 값에서 이 값을 뺍니다. 각 실험을 설정할 때 수행된 희석제에 따라 필요에 따라 값을 곱합니다.
이제, 경쟁 지수를 계산하거나 바코드 변형의 디지털 PCR 기반 정량화에서 경쟁 지수를 취소하여 유기체의 상대적 적합성을 결정한다. 모든 시간 지점에서 각 바코드 변형에 대해 이 단계를 수행합니다. AA 바코드를 포함하는 유전체 DNA는 다른 모든 바코드 게놈 DNA의 배경에서 희석되었다.
채널 1은 AA 바코드의 FAM 프로브를 나타내고 채널 2는 AO 바코드에 대한 HEX 프로브를 나타냅니다. 각 프로브의 결과는 선택된 우물에 있는 모든 물방울의 형광 강도의 주파수를 나타내는 개별 물방울 형광 진폭 및 히스토그램으로 제시됩니다. 각 조건에 대 한, 양성 및 부정적인 물방울 형성 해야 2 별개의 인구.
임계값 피쳐를 사용하여 인구를 분리하여 양수 및 음수 물방울을 정의해야 합니다. 임계값은 사용된 프로브에 따라 다르지만 동일한 프로브 믹스를 사용하는 모든 우물에는 동일한 임계값이 있어야 합니다. 희석된 AA의 경우, 히스토그램은 양수 방울이 음수물방울에 의해 실질적으로 열세이기 때문에 단일 인구만을 묘사하는 것으로 보입니다.
그러나, 2개의 명백한 인구는 왼쪽 패널에 있는 물방울 형광 진폭을 검토해서 아직도 보입니다. AA 바코드 게놈 DNA가 희석됨에 따라 양성 물방울의 감소가 있었고, 긍정적인 AO 물방울의 수는 일정하게 유지되었습니다. 모든 우물에 적절한 임계값이 적용되면 소프트웨어는 각 반응의 DNA 사본 수를 계산합니다.
연구의 일환으로 PCR을 일상적으로 수행하는 경우 이 기술을 수행하여 모델 유기체의 적합성을 평가할 수 있습니다. 이 절차는 일반적으로 업스트림 실험의 최종 결과를 결정하는 데 사용됩니다. 그것의 진정한 유틸리티는 세균 성 정량화에 의존하는 모든 실험에 대한 용이성과 다양성을 촉진하는 것입니다.
우리는 감염의 뮤린 모형에 있는 살모넬라 적합성을 평가하기 위하여 이 기술을 사용하고 있습니다. 추가적으로, 이 기술은 우리의 실험실에 있는 그밖 병원성 미생물과 사용하기 위해 적응되고 있습니다.
