새로운 획득한 저항 기계장치의 연구 결과는 내성 암 내성 및 절제성 암을 가진 환자에 있는 더 효과적이고 안전한 치료 전략의 발달에 기여할 것입니다. 불행히도 약물 내성이 발달하지 못한 경우는 일반적으로 보고되지 않습니다. 이 단계적 투여량 에스컬레이션 방법은 획득 저항 세포를 얻기위한 가장 신뢰할 수있는 기술로 간주됩니다.
적절한 아파티닙 저항 농도를 결정하기 위해, 배양 PC-9 세포는 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 10센티미터 세포 배양 처리 접시에서 성장 배지에서. 성장 중간 농도의 밀리리터 당 4 배-10-4 세포에서 PC-9 세포를 다시 중단하고, 96 웰 마이크로 플레이트에서 잘 세포 현탁액의 50 마이크로 리터에 세포를 시트. 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 인큐베이션 을 한 후, 50 마이크로리터의 아파티니브 용액을 잘 처리하고, 6개의 표시 농도의 복제에서, 컬 배양 인큐베이터에서 96시간 배양 후, MTT 염료 15마이크로리터를 각각 잘 첨가한다.
세포 배양 인큐베이터에서 4시간 후, 각 웰에 100마이크로리터의 용용성/스톱 용액을 추가하고 플레이트를 하룻밤 동안 인큐베이터로 되돌리십시오. 다음 날에는 마이크로플레이트 판독기에서 570나노미터의 광학 밀도를 측정합니다. 지속적인 아파티닙 노출을 위해, 세포가 수렴에 도달할 때까지 성장 배지의 10 밀리리터를 포함하는 P-100 접시에 있는 배양 PC-9 세포.
초기 배양식당 9밀리리터의 3개의 새로운 P-100 접시로 하위 배양을 옮기고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 보입니다. 다음 날 아침, 3개의 배양 요리의 각 세트에 afatinib의 반 최대 억제 농도의 0.1 나노 몰라, 또는 1/10을 추가합니다. 아파티닙 처리 된 세포가 하위 conconfluent될 때, 철저하게 배양을 혼합하기 위해 1 밀리리터 파이펫을 사용하고, 새로운 P-100 요리에서 신선한 성장 매체의 9 밀리리터에 각 접시에서 세포의 1 밀리리터를 전송합니다.
새로운 배양에 10%에서 20% 더 높은 농도의 아파티닙농도를 추가하여, 배양이 10~12개월 동안 수렴에 도달할 때마다 단계적 용량 에스컬레이션에 의한 아파티닙 농도를 증가시다. 1개의 micromolar의 afatinib 농도가 도달하면, 세포가 아파티닙 저항을 개발했다는 것을 확인하기 위하여 입증된 대로 MTT 분석기를 수행합니다. 세포주에 대한 성장 곡선을 결정하기 위해, 배양 부모 PC-9 및 세포 배양 인큐베이터에서 성장 배지에서 3개의 아파티닙 내성 세포주 24시간.
각 배양에서 세포를 성장 중간 농도의 밀리리터당 5배-10-3세포로 재보중단하고, 96웰 마이크로플레이트에서 각 세포 집단의 12 100마이크로리터 복제를 시트한다. 그런 다음 0일, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일 동안 MTT 분석을 시연한 대로 수행하고 적절한 통계 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 결과를 플롯합니다. 표피 성장 인자 수용체 또는 EGFR 게놈 DNA 발현의 변화를 규명하기 위해, 역전사 폴리머라제 사슬 분석에 의하여, 제조업체의 지시에 따라 DNA 정화 키트를 사용하여 관심 있는 세포 배양으로부터 게놈 DNA를 분리한다.
분광계에서 격리된 게놈 DNA의 25나노그램 마이크로리터 농도의 농도를 측정합니다. 그런 다음 SYBR 그린 마스터 믹스를 사용하여 50 나노그램의 게놈 DNA를 증폭시키고 형광계 역실사 중 폴리머라제 중합체 연쇄 반응 검출 시스템을 사용하여 결과를 분석한다. EGFR 게놈 DNA 발현의 체질을 시퀀싱하여 식별하려면 EGFR 엑슨 19 에서 21까지 특정 프라이머를 사용하여 게놈 DNA를 증폭시한다.
그런 다음 제조업체의 지시에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 증폭된 PCR 제품을 정화하고 앰플리턴을 시퀀싱합니다. 서양 얼룩 분석에 의한 표피 성장 인자 수용체 단백질 발현의 변화를 식별하려면 24시간 동안 아파티닙으로 세포를 치료한다. 24시간 후, 세척당 배양당 5밀리리터의 얼음-차가운 PBS로 세포 배양을 2회 세척합니다.
방사선 면역 강수량 분석 버퍼에서 세포를 lyse, 1 %의 프로테아제 억제제 칵테일과 인산 염 억제제 칵테일 2 및 3 섭씨 4도에서 30 분 보충. 인큐베이션의 끝에서, 원심 분리에 의해 용액을 수집합니다. 용액 샘플의 단백질 농도를 결정하기 위해 bicinchoninic acid 분석기를 사용합니다.
단백질 샘플을 마이크로리터 농도당 0.5 또는 마이크로그램 1개, 4-X 샘플 버퍼로 조정하고 샘플을 섭씨 96도에서 5분간 끓입니다. 시료의 서쪽 블롯 분석을 위해 에탄올 세척 유리 플레이트와 스페이서를 조립하고 적절한 실험 용 보충제로 8 % 폴리 아크릴 라미드 젤로 금형을적재합니다. 겔이 중합되는 동안, 적절한 금형에 스태킹 젤 용액을 추가하고 빗을 삽입하고 스태킹 젤이 실온에서 20~30분 동안 중합되도록 합니다.
두 젤이 중합되면 전기 전구 장치에 배치하고 탱크를 실행 버퍼로 채웁니다. 그런 다음 각 단백질 샘플의 20-30 마이크로리터 부피를 각 우물에 적재하고 180볼트에서 젤을 실행합니다. 약 60분 후에 전기전도를 멈추고, 염료 전면이 젤에서 흘러 나오면, 트웬으로 보충된 삼중 완충식식염으로 젤을 1~2분 간 세척합니다.
단백질을 폴리비닐리덴 불소 막에 반건조 블로팅으로 1시간 1/2시간 동안 300밀리암페어의 일정한 전류로 전달한다. 실온에서 1시간 동안 트리스 버퍼식식염수와 트위엔 용액으로 희석된 5% 무지방 건조 우유로 멤브레인을 차단합니다. 다음으로, 하룻밤 사이에 4도에서 관심있는 적절한 항체로 멤브레인을 조사하십시오.
다음 날 아침, 실온에서 1~1/2시간 동안 적절한 이차 항체에 멤브레인을 노출하기 전에 세척당 신선한 트리스 버퍼링 식염수 3개를 세척하여 멤브레인을 세척합니다. 그런 다음 세척당 신선한 트리스 버퍼식식염수로 멤브레인을 5번 세척하고 필름을 사용하여 신호 시각화를 위한 향상된 화학 발광 용액에 멤브레인을 노출시킵니다. 여기서, 아파티닙의 농도 증가에 대응하여 부모 PC-9 세포의 세포 증식에서 관찰되는 감소가 도시되고, PC-9 세포가 아파티닙 노출에 민감하다는 것을 확인한다.
그러나, 3개의 아파티닙 저항하는 세포주 중 어느 것도 아파티닙 노출 하에서 세포 증식의 억제를 보여주지 않는다. Afatinib 내성 세포주 부모 PC-9 세포보다 크게 느린 성장 곡선을 나타낸다. 아파티닙 내성 세포는 부모 PC-9 세포보다 EGFR 게놈 DNA 및 EGFR 단백질 발현의 상당히 높은 수준을 표현한다.
EGFR 시퀀싱은 PC-9 세포가 EGFR 엑슨(19)에서 15개의 염기 쌍 삭제, 그리고 엑슨(20)의 야생형 EGFR을 나타낸다는 것을 보여준다. 아파티닙 내성 1세포와 2개의 세포주 세포는, 그러나, 야생형 EGFR 엑온 19의 증폭을 나타낸다. 아파티닙 내성 세포주 3세포는 PC-9 세포와 같이 EGFR 엑슨 19에서 동일한 15개의 염기쌍 삭제를 함유하고 있으나, T790M의 포인트 돌연변이는 EGFR 엑슨 20에서 관찰된다.
억제제 농도가 IC-50 값에 가까우면 세포 성장이 매우 느려질 수 있습니다. 세포가 점진적으로 확산되기 때문에 문화에 대해 논의하지 마십시오. 이러한 전략은 암 환자가 획득 한 저항 메커니즘을 평가하고 안전하고 효과적인 치료 전략을 개발하기 위해 임상 관련 저항을 개발하는 조건을 모방하기 위해 개발되었다.
