이 프로토콜은 암 줄기 세포의 존재가 방사선 요법 후에 재발 또는 나쁜 결과와 연관될 수 있기 때문에 중요합니다. 방사능 줄기 세포를 연구하는 것은 방사능을 극복하기 위하여 단서를 제공할 수 있습니다. 이 기술에서, 암 줄기세포는 혈중 세포측정에 의한 putative 마커로 소금화되고 소금에 절인 세포의 자기 재생 능력은 구형성 분석에 의해 평가된다.
식민지 형성 분석은 소금에 절인 세포의 방사선 민감성을 평가하기 위해 수행됩니다. 그것은 얼마나 많은 세포 방사선의 특정 복용량 후 식민지를 형성 하는 합성을 생성 하는 그들의 능력을 잃었 결정. 이 원고는 암 줄기 세포의 방사선 반응성 연구를위한 초기 몇 가지 단계를 제공하며, 이는 완전한 메커니즘 연구의 기초를 확립합니다.
메커니즘 연구는 DNA 손상 수리, 반응성 산소 종의 정리, 세포 주기 체포 등과 관련된 단백질을 포함 할 수 있습니다. 그것은 암 줄기 세포가 방사능을 얻는 방법과 저항을 극복하는 방법에 중요한 통찰력을 제공할 것입니다. 방사선 절차를 시연하는 것은 우리 부서의 방사선 기술자 인 첸난 리 (Chen-Nan Li)가 될 것입니다.
이 절차를 시작하기 위해 RPMI-1640 배지의 배양 A549 세포는 섭씨 37도에서 10센티미터 요리에 10%의 FBS로 보충되었으며 이산화탄소는 5%입니다. 세포가 80 ~ 90%에 도달하면 배양 배지를 제거합니다. PBS의 3 밀리리터로 세포를 간략하게 씻으시면 됩니다.
다음으로 각 요리에 0.05%의 트립신 3밀리리터를 추가합니다. 트립신을 제거하고 1 ~ 3 분 동안 섭씨 37도에서 세포를 소화하기 위해 거주 트립신을 둡니다. 과다 소화를 피하기 위해 세포의 분리를 자주 확인하십시오.
세포가 느슨해지고 접시에서 분리되기 시작하면 10 %의 FBS로 보충 된 RPMI-1640 배지 3 밀리리터를 추가하고 세포 현탁액을 50 밀리리터 튜브로 옮긴다. 원심 분리기는 300배, 섭씨 4도에서 5분간. 상체를 버리고 PBS의 10 밀리리터에서 세포를 다시 중단하십시오.
세포 현탁액의 0.5 밀리리터를 새로운 튜브로 이관형 대조군으로 옮기다. 원심분리기는 대조군과 실험용 튜브를 300배, 섭씨 4도에서 5분간 분리합니다. 초월체를 폐기합니다.
이어서, PBS에서 형광 디콘주게이트이있는 동형 조절 및 항체를 모두 희석하여 작업 용액을 준비하기 위해 적정 농도를 정성화한다. 각 작업 용액으로 제어 및 실험 셀을 다시 중단하고 부드럽게 섞습니다. 어두운 시료와 실온에서 30~40분 동안 시료를 배양합니다.
PBS의 10 밀리리터를 추가하고 부드럽게 혼합하고 300 배 g와 섭씨 4도에서 5 분 동안 원심분리를 추가하여 세포를 씻으십시오. 슈퍼네이터를 버리고 PBS의 10 밀리리터로 세포를 다시 중단합니다. 다음으로, 새로운 50 밀리리터 튜브에 40 마이크로미터 세포 스트레이너를 배치하여 제어 및 실험 용 세포를 위한 별도의 튜브 및 스트레이너 설정을 준비하십시오.
각 셀 서스펜션을 각 스트레이너에 적용하고 흐름을 수집합니다. 원심 분리는 300 배 g와 섭씨 4도에서 5 분 동안 흐르는 흐름을 전달합니다. 상체를 버리고 PBS의 0.2 ~ 1.0 밀리리터로 세포를 다시 중단하고 각 세포 현탁액을 별도의 5 밀리리터 튜브로 이송하여 유동 세포 측정을 합니다.
생물학적 안전 캐비닛에서, 제로 그레이 그룹을 포함하여 각 방사선 량에 대해 하나의 6 개의 우물 플레이트를 준비합니다. 각 웰에 1640개의 용지를 완성한 1.5밀리리터를 추가합니다. 1640개의 세포 밀도로 수확된 세포를 밀리리터당 1, 000세포의 세포 밀도로 희석시켰다.
그런 다음 희석된 세포 현탁액을 우물에 넣고 플레이트를 수평으로 흔들어 우물에 세포를 균등하게 분배합니다. 각 투여량 그룹에 추가된 볼륨을 기록합니다. 이산화탄소 5%를 가진 섭씨 37도의 배양.
세포가 우물 바닥에 부착된 후 미디어 높이가 1센티미터에 도달할 때까지 각 웰에 완료된 1640개의 미디어를 추가합니다. 플레이트가 세포 배양실과 방사선 요법실 간에 전달되면 접시를 알루미늄 호일로 감싸거나 오염을 피하기 위해 깨끗한 상자에 넣습니다. 중간 크기유출을 피하기 위해 접시를 평평하게 유지합니다.
다음으로, 20센티미터 방사선 장에 의해 20 센티미터로 설정합니다. 치료 소파에 1.0 센티미터 두께의 조직 동등한 볼러스를 놓고 접촉하도록 볼루스에 6 개의 우물 판을 놓습니다. 전체 플레이트가 방사선 장 내에 있는지 확인합니다.
소스-피부 거리를 100cm로 설정하고 처리 소파의 높이를 조정하여 중간 표면 레벨을 레이저 레벨에 정렬합니다. 각 플레이트에 배정된 용량을 순서대로 전달합니다. 그 후, 세포 배양실의 생물안전 캐비닛에 판을 가져 가라.
매1640 배지의 2밀리리터로 매질의 배지를 교체한다. 이산화탄소 5%를 가진 섭씨 37도의 문화는 3~5일마다 매체를 변경합니다. 방사선 후 7~10일 후에 는 배지를 제거하고 PBS로 세포를 간단히 씻어낸다.
연기 후드에, 10 분 동안 세포를 해결하기 위해 각 우물에 4 %의 포름알데히드의 1 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 포름알데히드를 제거하고 각 세척에 대해 증류수 2 밀리리터를 사용하여 두 번 잘 씻습니다. 1밀리리터1%의 크리스탈 바이올렛 얼룩 액액을 각 웰에 넣고 10분 동안 염색합니다.
그 후, 크리스탈 바이올렛 얼룩 용액을 제거하고 증류수로 세포를 세 번 씻는다. 물을 제거하고 접시가 30 분 동안 건조하게하십시오. 50개 이상의 세포를 가진 식민지수를 계산합니다.
이 연구에서는 알파 2 델타 1개의 높은 및 알파 2 델타 1개의 낮은 A549 세포가 정렬됩니다. 일부 마커는 뚜렷한 인구를 표시할 수 있으며 게이트가 용이합니다. 그러나 일부 마커는 특유의 긍정 및 음수 집단이 아닌 높고 낮은 식 패턴을 보여줍니다.
이 경우, 등류형 컨트롤은 게이팅에 매우 중요합니다. 정렬된 셀에서 알파 2 델타 1의 발현은 qPCR에 의해 검증됩니다. 알파 2 델타 1을 인코딩하는 유전자인 CACNA2D1의 발현은 분류된 알파 2델타 1개의 고세포에서 알파 2델타 1개의 낮은 세포와 비교하여 더 높다.
구체의 전형적인 형태와 구 형성 효율이 여기에 나와 있다. 알파 2 델타 하나의 높은 셀은 더 높은 자기 재생 용량을 제안, 더 높은 구 형성 효율을 보여줍니다. 식민지와 생존 곡선의 전형적인 이미지는 여기에 표시됩니다.
약 50개의 세포를 가진 식민지는 현미경의 밑에 검사되고 참조로 표시될 수 있습니다. 식민지의 수는 계산되고, 각 복용량에서 생존 분수를 계산하고 생존 곡선을 플롯할 수 있습니다. 알파 2 델타 1 개의 높은 세포는 알파 2 델타 1 개의 낮은 세포에 비해 방사선에 상대적으로 저항한다.
세포 배양과 관련된 모든 단계는 생물학적 안전 캐비닛 또는 라미나르 클린 벤치에서 수행되어야 합니다. 오염을 피하기 위해 분류 후 배양 배지에 항생제를 추가하는 것이 좋습니다. putative cancer 줄기 세포 마커가 구형성 분석에 의해 예습적으로 확인되면, 생체 내에서 희석 분석법을 제한하는 추가 특성화는 종양 성 용량을 평가하기 위해 수행될 수 있다.
방사능 의 메커니즘 연구에서, 연구원은 DNA 손상 복구와 관련된 단백질을 검사 할 수 있습니다, 반응성 산소 종의 통관, 방사선에 대한 응답으로 세포 주기 체포. 세포 방사선 동안, 선형 가속기는 자격을 갖춘 기술자에 의해서만 작동할 수 있다는 점에 유의하십시오. 방사선을 멀리하십시오.
서 있는 동안 포름알데히드는 휘발성이 높고 위험합니다. 연기 후드에 포름알데히드를 사용하십시오.
