제브라피쉬 세포주를 사용한 세포독성 분석 프로토콜은 어류에 대한 화학 물질의 급성 독성에 관한 질문에 답하거나 다른 대체 어류 분석에 대한 적절한 테스트 농도를 정의하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 96웰 플레이트 분석의 주요 장점은 생태독성 연구에서 중요한 어종인 제브라피쉬 세포에 대한 세포독성을 결정하기 위해 서로 다른 생존력 종점을 결합한다는 것입니다. 프로토콜은 매우 간단합니다.
설명 된 모든 단계를 올바르게 수행하면 문제가 발생하지 않습니다. 이 프로토콜은 배아 세포의 간세포와 같은 다른 기관 또는 생활 단계에서 파생된 어류 세포주에서 효과를 평가하는 동물 기반 생태 독성 연구를 달성하는 데 도움이 되지 않습니다. ZEM2S 또는 ZFL 세포 플레이팅을 시작하려면 분석을 위해 원하는 세포 수를 얻는 데 필요한 각 세포 현탁액의 부피를 계산합니다.
멸균 시약 저장소를 해당 세포주에 대한 완전한 배양 배지로 채우고 계산 된 세포 현탁액 부피를 총 부피 20 밀리리터의 저장소로 옮깁니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 거품이나 기포를 형성하지 않고 용액을 위아래로 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 다중 채널 마이크로 피펫을 사용하여 투명 폴리스티렌 96 웰 플레이트의 각 웰에 200 마이크로 리터의 세포 현탁액을 추가하여 ZEM2S 세포의 경우 웰 당 60, 000 개의 세포, ZFL 세포의 경우 웰 당 40, 000 개의 세포.
플레이트를 섭씨 28도에서 24시간 동안 배양합니다. 두 유형의 세포를 서로 다른 농도의 테스트 화학 물질에 노출시키려면 소 태아 혈청 또는 FBS가 없는 관심 세포주에 대한 배양 배지에서 원하는 농도의 테스트 화학 용액을 준비합니다. 24시간 배양 후, 다채널 마이크로피펫을 사용하여 웰로부터 소모된 배지를 조심스럽게 버린다.
그런 다음 웰 당 100 마이크로 리터의 특정 테스트 화학 용액을 기술 삼중으로 추가하며, 이는 각 테스트 화학 물질 농도에 대해 3 개의 웰을 의미합니다. 대조군을 테스트 화학 물질과 동일한 플레이트에 기술 삼중으로 배치합니다. 블랭크 대조군의 경우, 100마이크로리터의 노출 매체를 3개의 무세포 웰에 추가합니다.
음성 대조군의 경우, 100 마이크로리터의 노출 배지를 세포를 함유하는 3개의 웰에 첨가한다. 양성 대조군의 경우, 세포가 포함된 3개의 웰을 노출 배지에서 준비된 1%Triton X-100 용액에 노출시킵니다. 배양 배지 증발을 방지하기 위해 플레이트를 파라필름 또는 접착 밀봉 호일로 밀봉하고 플레이트를 섭씨 28도에서 24시간 동안 배양합니다.
시험 화학물질 노출 24시간 후, 내용물을 수집 트레이에 붓고 각 웰을 200 마이크로리터의 PBS로 세척하여 웰로부터 노출 매체를 조심스럽게 버린다. 그런 다음 세포를 잃지 않고 PBS를 제거하려면 조심스럽게 수집 트레이에 붓습니다. Alamar Blue 또는 AB 및 CFDA-AM 분석을 수행하기 위해 웰당 100 마이크로리터의 각 용액을 추가하고 플레이트를 섭씨 28도의 암실에서 30분 동안 배양합니다.
다음으로, 형광 플레이트 판독기에서 텍스트에 언급된 적절한 여기 및 방출 파장에서 형광을 측정합니다. 중성 적색 또는 NR 분석을 수행하려면 밀리리터당 40마이크로그램 농도의 NR 작업 용액을 취하고, 600G에서 10분 동안 원심분리한다. 그런 다음 내용물을 수집 트레이에 부어 이전에 추가한 AB 및 CFDA-AM 용액을 웰에서 조심스럽게 제거합니다.
다중 채널 마이크로피펫을 사용하여 웰당 100마이크로리터의 NR 작업 용액을 추가하고 플레이트를 섭씨 28도에서 3시간 동안 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 플레이트의 NR 용액을 수집 트레이에 조심스럽게 붓고 웰당 150마이크로리터의 PBS를 추가하여 웰을 세척합니다. 세척 후 웰 당 150 μliters의 NR 추출 용액을 첨가하고 플레이트 판독기를 사용하여 540 나노미터에서 흡광도를 측정하기 전에 플레이트 쉐이커에서 10분 동안 부드럽게 흔들어 플레이트를 배양합니다.
MTT 분석을 수행하기 위해 24시간 테스트 화학 물질 노출 후 내용물을 수집 트레이에 붓고 다중 채널 마이크로피펫을 사용하여 노출 매체를 조심스럽게 제거하고 어둠 속에서 웰당 100마이크로리터의 MTT 작업 용액을 추가합니다. 접시를 섭씨 28도에서 어둠 속에서 4 시간 동안 배양하십시오. 그런 다음 내용물을 수집 트레이에 붓고 100 마이크로 리터의 DMSO를 각 웰에 첨가하여 포르 마잔 결정을 추출하여 MTT 용액을 버립니다.
플레이트 판독기를 사용하여 517 나노미터에서 흡수를 측정하기 전에 플레이트 셰이커에서 플레이트를 10분 동안 배양합니다. AP 분석의 경우, 블랭크, 양성 대조군 및 높은 세포 독성 농도의 테스트 화학 물질에 해당하는 웰은 생존 세포의 부재 또는 감소를 나타내는 청색 및 낮은 형광을 나타냈다. 대조적으로, 많은 수의 생존 세포를 함유하는 시험 화학물질 및 음성 대조군의 낮은 세포독성 농도에 상응하는 웰은 레사주린을 더 높은 형광을 갖는 분홍색 레조루핀으로 전환시켰다.
NR 분석의 경우, 시험 화학물질 및 양성 대조군의 세포독성이 높은 농도는 투명하거나 옅은 분홍색이며 흡광도가 낮은 반면, NR 염료를 유지하는 생존 세포를 포함하는 웰은 짙은 분홍색과 높은 흡광도를 나타냈습니다. 유사하게, MTT 분석의 경우, 생존 세포가 없는 웰은 투명한 반면, 생존 세포가 포함된 웰은 MTT를 보라색 포르마잔으로 변환합니다. 계산된 세포 생존율 백분율에 기초하여, ZFL 및 ZEM2S 세포주의 상이한 시험 화학물질에 대해 절반 최대 억제제 농도 또는 IC50 값을 추정하였다.
FBS가 있는 배양액과 FBS가 없는 배양액에서 세포 생존율의 유의미한 차이가 관찰되지 않았으며, 이는 24시간의 화학적 노출 기간 동안 FBS가 결핍된 배양 배지의 적합성을 나타냅니다. MTT 및 NR 분석은 세포 생존율에 0.1%에서 1%까지 다양한 DMSO 농도가 유의미한 영향을 미치지 않았으며, 이는 이러한 세포주가 최대 1%까지 DMSO를 용매로 사용할 수 있음을 나타냅니다전체 절차 동안 자체 분리를 피하기 위해 도금된 세포를 취급하는 동안 특별한 주의를 기울이고 염료 침전을 피하기 위해 중성 적색 작업 용액을 조심스럽게 준비하십시오. 이 절차는 시험관 내 모델을 사용하여 어류에 대한 화학적 영향의 여러 측면을 다루는 연구에 적용될 수 있으며 동물 기반 생태 독성 연구의 진행에 기여할 수 있습니다.
