라파마이신/mTOR 상호 작용을 연구하기 위한 반정량적 약물 선호도 반응 형 표적 안정성(DARTS) 분석

약물 친화성 반응 대상 안정성, DARTS는 새로운 소분자 단백질 표적을 검출하는 견고한 방법입니다. 그것은 알려진된 작은 분자 단백질 상호 작용을 확인 하 고 천연 제품에 대 한 잠재적인 단백질 목표를 찾기 위해 사용할 수 있습니다. 이 연구에서는 단백질 안정성의 변화를 모니터링하고 단백질 리간드 상호 작용의 선호도를 추정하여 DARTS 실험의 데이터 분석 기능을 더욱 향상시킵니다.

단백질 리간드 상호 작용은 두 개의 곡선, 프로테오리스틱 곡선 및 용량 의존 곡선에 대해 플롯될 수 있습니다. 우리는 mTOR-라파마이신 상호 작용을 프로토콜 의정서 의정서 의결을 위한 모범적인 사례로 사용했습니다. 10%의 태아 소 혈청, 2밀리알라 글루타민 및 1%항생제로 DMEM을 사용하여 293T 세포를 성장시하십시오.

이산화탄소 5% 미만의 섭씨 37도에서 배양합니다. 배양이 80~90%에 도달하면 감기 PBS로 세포를 두 번 씻으시다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 적당한 양의 콜드 셀 리시스 버퍼로 수집하고 용액 세포를 1.5mm 튜브로 옮춥니까.

용해 버퍼와 용해 세포를 잘 혼합하고 10 분 동안 얼음에 튜브를 배양하는 반전. 18, 000배 g에서 4도에서 10분간 튜브원심분리합니다. 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 상수 체재를 옮기고 얼음 위에 차가운 상태를 유지합니다.

BCA 분석법을 수행하여 용액의 단백질 농도를 근사화하고 단백질 농도에 따라 pronase의 희석을 계산합니다. 첫째, 용액을 각각 99개의 1.5밀리리터 튜브, 99개의 마이크로리터로 옮킨다. 각 알리사테에 소분자 스톡 용액 1개를 추가하고 실온에서 30~60분 동안 두 튜브를 배양합니다.

얼음에, 1x TNC에 갓 해동 pronase 솔루션의 직렬 희석을 설정합니다. 작은 분자와 인큐베이션에 따라, 다섯 개의 튜브에 있는 견본의 20 마이크로 리터로 각 알리쿼트분할. 동일한 소화 시간을 보장하기 위해 30초마다 특정 간격으로 준비된 pronase 솔루션의 마이크로리터 2개를 그에 따라 샘플에 추가합니다.

하나의 제어 그룹의 경우 TNC 버퍼의 마이크로리터 2개를 추가합니다. 5~20분 후, 30초 간격으로 차가운 20x 프로테아제 억제제 칵테일 2개의 마이크로리터를 추가하여 6개의 튜브의 소화를 중단합니다. 잘 섞어서 얼음에 10분간 배양하세요.

각 샘플을 5x SDS-PAGE 적재 버퍼6개소로 희석하고 10분 동안 수조에서 샘플을 끓입니다. 이제, 서양 블롯을 수행하기 위해, 적절한 분자량 마커와 함께 8 % SDS-PAGE 젤의 우물에 동일한 양의 단백질을적재합니다. 80볼트에서 30분 동안 젤을 실행한 다음 전압을 120볼트로 조정한 다음 1~2시간 동안 계속 실행합니다.

작은 분자가 잠재적인 표적 단백질에 직접 결합할 수 있는지 확인하십시오. 이 프로토콜에서, 작은 분자를 가진 잠복은 proteolysis에 대하여 보호를 확인했습니다. 세 밴드는 차량 제어를 통해 라파마이신과 잠복에 의해 보호되는 것으로 밝혀졌다.

서양 블로팅은 단백질 비율에 낮은 pronase에서 mTOR 단백질의 존재를 설명하고 증가 비율로 감소 및 손실. pronase에 의한 mTOR의 프로테오리시스는 라파마이신의 존재에 의해 명백히 억제되었고 라파마이신의 첨가는 프로테오리스틱 곡선에서 명백한 변화를 일으켰다. 라파마이신 용량에 따라 mTOR의 수준을 향상, 라파마이신 치료와 mTOR의 상승 안정성을 제안.

표적 단백질 밴드 강도의 정량화는 mTOR이 라파마이신의 표적 단백질임을 시사한다. 최상의 단계적 효과를 얻기 위해, 이 실험은 단백질 비율보다 적절한 범위의 pronase를 얻기 위해 여러 번 반복되어야 할 수도 있다.