소형 돼지에서 1 차 대동맥 내피 세포의 격리 및 배양

이 방법은 소형 돼지로부터 내피 세포를 격리시키는 매우 효과적인 방법입니다. 그리고 세포도 확장될 수 있고, xeno이식에서 면역 및 응고 반응을 조사한다. 기술의 주요 장점은 돼지로부터 고도로 정제된 내피 세포를 분리하는 것이 쉽고 매우 효과적일 뿐만 아니라 다른 PC를 통과할 때 유지하는 것이 더 낫다는 것입니다.

마취돼지의 통증 반사에 대한 반응의 부족을 확인한 후, 돼지 복벽을 75%의 의료 알코올로 3회 세척하고 요오드 1개를 씻어낸다. 마지막 세척 후 메스를 사용하여 복부 절개를 하여 열등한 베나 카바를 노출시키고 5밀리리터 주사기를 사용하여 5000단위의 헤파린 나트륨을 열등한 베나 카바에 주입합니다. 5분 후, 카테터를 복부 대어타에 삽입하고 메스를 사용하여 다이어프램을 절개합니다.

두 번째 조사자의 도움으로 왼쪽 심실을 제거하고 뼈 집게를 사용하여 갈비뼈를 절제하여 심장과 폐를 노출시합니다. 대자 후방을 심장과 폐에 찾아 끝을 고정시다. 가위를 사용하여 대어타를 소비하고 미리 냉각된 세척 버퍼로 한 번 세척합니다.

멸균 집게와 가위로 대어타 주변에 과도한 조직을 제거하고, 실험실로 이송하기 위해 신선한 미리 냉각된 세척 버퍼를 포함하는 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 용기를 놓습니다. 돼지 대동맥 내피 세포 절연의 경우 돼지 대동맥을 무균 조건하에서 150mm 페트리 접시로 옮기고 혈관의 양 끝을 부드럽게 제거하십시오. 혈관이 고정된 여분의 여분의 조직을 멸균 집게와 가위로 다듬고 20~50밀리리터의 신선한 세척 버퍼를 사용하여 대오르타 의 외부와 내부를 헹구세요.

다음으로, 대자를 통해 외과 봉합사를 전달하고, 느슨하게 혈관의 한쪽 끝을 묶어 루멘 내에서 봉합사를 유지합니다. 집게로 묶인 끝 부근의 대어타를 부드럽게 고정한 다음 수술 봉합사를 천천히 당겨 대마의 내피 표면이 노출될 때까지 대마를 반전시다. 대마의 내피 표면을 세척당 신선한 세척 버퍼 10 밀리리터로 세 번 씻고 대마를 15 밀리리터 원심분리기 튜브에 넣습니다.

샘플을 섭씨 37도의 10 밀리리터로 덮고 0.005%의 콜라게나아제 IV 소화용액을 데우고, 15분 동안 37°C에서 조직을 배양한다. 인큐베이션이 끝나면 전체 튜브 내용물이 100mm 배양 접시로 옮기고, 미리 냉각된 정지 버퍼의 10~15밀리리터로 소화를 체포한다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 용기의 내부 표면에서 대동맥 내피 세포를 부드럽게 제거하고 세척당 5 밀리리터의 세척 버퍼로 용기를 세 번 씻습니다.

마지막 세척 후, 50 밀리리터 원심분리기 튜브로 상체를 옮기고, 50 밀리리터 튜브의 세척을 당 5 밀리리터의 신선한 세척 버퍼로 문화 접시의 바닥을 두 번 씻습니다. 원심 분리에 의해 세포를 수집하고, 상류체의 마지막 10 밀리리터를 제외한 모든 폐기. 20 밀리리터의 세척 버퍼를 추가하여 펠릿을 재일시 중단하고 거품을 피하고 다른 원심 분리로 세포를 수집합니다.

계산을 위해 세포 배양 배지의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 25센티미터 제곱 플라스크 농도당 6개의 세포에 11회 10시에 세포를 플레이트한다. 그런 다음 세포 배양 인큐베이터에 세포를 5%의 이산화탄소에 섭씨 37도에 놓고 2~3일마다 배지를 상쾌하게 한다. 격리 후, 내피 세포는 0일, 1, 2일에 검사되고, 오염 및 형태학적 평가를 위해 1개와 2개의 구절 후에 검사됩니다.

항 CD31-FITC 항체를 이용한 유동 세포 분석은 배양 3일째에 전형적으로 97%이상의 내피세포 마커 양성 집단을 나타내며, 이는 두 구절 후에도 90% 이상의 순도로 유지된다. 대자의 내피 표면은 셀 스크레이퍼로 10배 미만의 한 방향으로만 긁어내고, 스크래핑 과정에서 압축되지 않았다. 가장 좋은 대답, pAEC 격리의 최적화 된 방법, 우리는 개별 실험을 수행하고 xeno 이식에서 면역 거부 및 응고 반응을 조사하기 위해 정제 된 pAEC를 사용할 수 있습니다.