증식은 세포 기능의 중요한 척도입니다. 이 프로토콜을 통해 조사관은 시판되는 키트의 높은 비용없이 실험실에서 민감한 확산 분석기를 개발할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포의 가혹한 처리 및/또는 방사능사용을 피한다는 것입니다.
이 기술을 시연하는 것은 내 실험실의 매니저인 비키 웡(Vicky Wong)이 될 것입니다. 증식을 분석하기 위해, 96웰 플레이트에서 DMEM의 밀리리터 당 20, 000 세포에서 2%의 태아 소 혈청 및 플레이트에서 2%의 태아 소 혈청및 플레이트로 매끄러운 근육 세포 매체를 가진 플라스크에서 혈관 매끄러운 근육 세포를 제거하십시오. 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 세포를 성장시다.
확산을 자극하는 긍정적인 컨트롤로 밀리리터 혈소판 유래 성장 인자당 30 나노그램을 3~6개의 우물에 첨가합니다. 그런 다음 음수 컨트롤과 동일한 수의 우물에 PBS를 추가합니다. 72시간 동안 배양합니다.
이전에 준비된 5개의 밀리몰러 EdU 스톡을 1밀리몰라에 희석하고 72시간 배양 기간의 마지막 24시간 동안 각 웰에 마이크로리터 2개를 추가합니다. 배경 형광 및 발광을 결정하기 위해 EdU없이 복제 한 세트를 유지합니다. 24시간 후, 미디어를 제거하여 세포를 수정한 다음, 4%의 파라포름알데히드의 웰당 150마이크로리터를 추가하고 실온에서 10분을 배양합니다.
파라포름알데히드를 제거하고 우물당 물에 1%TX-100의 150 마이크로리터를 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. TX-100을 제거하기 위해 PBS로 세 번 세척하십시오. 형광을 사용하여 통합 된 EdU를 감지하려면, 올바른 순서로 재고 솔루션에서 시약을 추가하여 사용하기 직전에 96 웰 플레이트 당 라벨링 용액 10 밀리리터를 만듭니다 : 20 마이크로 리터 THPTA, 20 마이크로 리터 구리 황산염, 5 마이크로 리터 플루오레세인 피콜릴 - 아지드, 100 마이크로 리터 는 100 마이크로 리터의 PBS에 밀리터로 밀리터로 밀리터.
가장 중요한 단계는 사용하기 직전에 라벨링 솔루션을 만드는 것입니다. 우물에서 PBS를 제거하고, 각 우물에 150 마이크로리터의 라벨링 솔루션을 추가하고 섭씨 37도에서 30분을 배양합니다. 모든 핵을 검출하려면 형광 현미경 또는 이미징 플레이트 판독기에서 각 우물과 이미지에 DAPI를 추가합니다.
수동 계수를 방지하고 이미징 플레이트 판독기를 사용할 수 없는 경우 이 프로토콜을 HRP 아지드 및 ELISA 기판을 사용하여 발광 판독기로 수정할 수 있습니다. 발광을 사용하여 EdU를 감지하려면 먼저 0.1% 폴리소르바테 20으로 트리스 버퍼링식 식염수(triss 버퍼링식 식염수)를 준비합니다. 그런 다음 각 우물에 150 마이크로리터의 블로킹 버퍼를 추가하고 실온에서 90 분 동안 배양하십시오.
차단 버퍼를 제거한 후 PBS 의 200 마이크로리터로 셀을 세 번 세척하십시오. 통합 된 EdU를 감지하려면 먼저 재고 솔루션의 시약을 올바른 순서로 추가하여 96 웰 플레이트 당 라벨링 솔루션 10 밀리리터를 준비하십시오. 첫째, 20 마이크로 리터 THPTA, 다음 20 마이크로 리터 구리 황산염, 5 마이크로 리터 비오틴 피콜릴 - 아지드, 100 마이크로 리터 나트륨 아스코르바트 PBS에 총 부피 10 밀리리터.
TBST 의 200 마이크로 리터와 함께 5 번 3 분 우물을 흔들어 씻으시다. 실온에서 20분 동안 150마이크로리터의 과산화수소 0.3%의 마이크로리터를 담금질합니다. 과산화수소를 제거한 후 TBST 200 마이크로리터로 5회 3분간 흔들어 주세요.
TBST에 희석된 스트렙타비딘-고추냉이 과로시다아제 50마이크로리터를 각 우물에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. TBST 의 200 마이크로 리터와 함께 5 번 3 분 세척 흔들어. 각 웰에 화학 발광 ELISA 기판의 50 마이크로 리터를 추가하고 발광을 감지 할 수있는 플레이트 리더에서 즉시 읽어보십시오.
형광 핵은 표준 형광 판 판독기에 의해 검출될 수 있지만, 발광 프로토콜을 사용하여, 형광 스캔은 연쇄상 구하 와옥시다제 및 표준 ELISA 기판으로 검출된 균질성 액체 판독으로 변환됩니다. 형광 판독에 비해 이 방법의 장점은 보다 균일한 판독이며 PDGF에 대한 응답으로 VSMC의 증식이 측정되었을 때 여기에서 볼 수 있듯이 플레이트를 몇 초 만에 읽을 수 있다. 단점은 배경이 형광보다 높기 때문에 부정적인 컨트롤이 더 높은 경향이 있다는 것입니다.
가변성을 줄이기 위해 결과 초기 셀 수로 정규화되었습니다. 그러나, 별도의 실험 세트에서, 이 방법은 세포 수의 작은 차이를 검출하기에 충분히 민감하지 않다는 것을 보여주었다. EdU 양성 및 총 세포를 계산하는 가장 효율적이고 정확한 방법은 이미징 플레이트 판독기를 사용하는 것입니다.
이러한 유형의 플레이트 판독기를 사용할 수 없는 경우 수동 계산도 정확한 결과를 얻을 수 있습니다. 이 두 가지 방법을 비교할 때 EdU 양수 수동 수는 자극되지 않은 총 수와 동일한 자동 수와 동일합니다. 이 두 가지 방법의 장점은 계산될 세포의 가시성, 향상된 정확도 및 파편의 비특이적 염색을 보고 피할 수 있다는 것입니다.
수동 계수 방법의 주요 단점은 시간입니다. 라벨링 솔루션을 사용하기 직전에 신선하게 만들고 서면 프로토콜에 제공된 순서대로 재료를 추가해야 합니다. 염색 강도가 희미하면 첼로이터를 구리 비율에 맞게 조정해 보십시오.
파라포름알데히드가 독성이 있다는 것을 기억하십시오. 장갑을 끼고 연기 후드에 사용해야합니다. 절차 자체는 어렵지 않지만 라벨링 솔루션에서 첼레이터를 구리 비율에 맞게 조정하여 최적화해야 할 수 있습니다.
또한, EdU 치료의 인큐베이션 시간 및 길이는 요구되는 세포 유형 및 특정 질문에 따라 조절될 수 있다. 이 기술은 세포 표면 및 세포 내 염색과 호환되므로 분할 및 비 분할 세포의 특성을 결정할 수 있습니다. 일반적으로 증식을 측정하는 데 사용되지만, 클릭 화학은 RNA, 단백질, 지방산 및 탄수화물의 대사 라벨링에도 사용될 수 있습니다.
관심의 대사 대상이 세포 표면에 있는 경우에, 살아있는 세포는 표지될 수 있습니다.
