비코딩 RNA에는 여러 동위 형태가 있는 경우가 많습니다. 시험관 내 과발현 연구에서는 이러한 표현된 모든 등소 형태를 연구하기가 종종 어렵습니다. 이 기술은 사용자가 게놈으로부터 직접 발현을 도출하고 세포가 특정 비코딩 RNA에 대한 내인성 동소형을 발현할 수 있게 한다.
이 강력한 기술은 사용자가 충실도와 정확도로 게놈내의 모든 유전자의 발현을 구체적으로 지시할 수 있게 합니다. 특정 유전자에 대한 가이드 RNA를 설계함으로써 내인성 유전자 접합 기계를 사용하여 주어진 세포에서 천연 동소형을 발현할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 후 로버트 랭킨이 될 것입니다.
전사 시작 부위의 100개의 기본 쌍 내에 위치한 가이드 RNA 서열을 설계하려면 BLAT와 같은 유전자 데이터베이스를 사용하여 가이드 RNA가 관심 유전자에 고유한지 확인합니다. 가이드 RNA와 비활성화된 Cas9 플라스미드를 섭씨 4도에 저장합니다. 암피실린을 곁들인 루리아 국물 한마접시에 E.coli를 줄이며 하룻밤 사이에 37도에서 박테리아를 재배합니다.
다음 날, 식민지를 선택하고 하룻밤 암피실린과 LB의 5 밀리리터에서 박테리아를 성장, 적극적으로 37도 섭씨 인큐베이터에서 튜브를 흔들어. 다음 날, 2 리터 플라스크에 암피실린과 LB의 200 밀리리터에 박테리아의 두 밀리리터를 추가, 적극적으로 37도 섭씨 인큐베이터에서 하룻밤 플라스크를 흔들어. 박테리아를 3, 724시간 g에서 20분 동안 스핀다운하고 DNA 정화로 진행합니다.
dCas9 함유 렌즈바이러스를 만들기 위해, 첫 번째 코트 100 밀리리터 조직 배양 접시 와 5 밀리리터 0.01% 폴리-L-리신 및 플레이트 당 5 백만 HEK293T 세포 10 밀리리터의 완전한 덜벡코의 수정 된 독수리 매체, 그런 다음 LTR 함유 가이드 RNA 벡터 의 10 마이크로그램 또는 LTR 함유 비활성화된 Cas9 벡터를 바이러스 성분을 함유한 플라스미드와 혼합하여 DNA 전환 샘플을 준비한다. 총 450마이크로리터에 물을 추가하고 주사기에 부착된 0.2미크론 필터 팁을 통해 혼합물을 필터링합니다. 다음으로, DNA의 각 트랜스펙트 샘플에 2.5-어금니 칼슘 이산화제 50마이크로리터를 추가하고 부드럽게 섞는다.
주사기에 부착된 0.2미크론 필터 팁을 통해 칼슘-DNA 혼합물을 걸이합니다. 파이펫 500 마이크로리터 2X HBS를 5밀리리터 폴리스티렌 튜브에 넣습니다. 칼슘-DNA 혼합물 500마이크로리터를 드롭와이즈와 부드럽게 소용돌이에 넣습니다.
실온에서 3분간 배양하세요. 각 HEK293T 함유 조직 배양 접시에 DNA 칼슘 HBS 현탁액 1밀리리터를 넣고 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소 인큐베이터에 배양합니다. 셋째 날에는 천천히 제거하고 접시에서 미디어를 폐기하십시오.
조심스럽게 한 번 PBS로 세포를 씻어. 20 밀리머 HEPES와 10 밀리머 나트륨 부티레이트로 보충 된 완전한 DMEM의 6 밀리리터를 추가하십시오. 그런 다음 5~6시간 동안 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소 인큐베이터로 세포를 배양합니다.
인큐베이션 후, PBS로 세포를 한 번 세척하고 HEK293T 세포에 20 밀리머 헤페스와 함께 완전한 DMEM의 5 밀리리터를 추가합니다. 12시간 동안 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 4일째에는 HEK293T 세포 수퍼나티를 수집하고 바이러스를 함유하는 수퍼나티를 필터링한다.
바이러스 성 입자 수를 시작하려면 먼저 증류수의 19 부분을 추가하여 P24 ELISA 키트에서 세척 농축물을 희석시하십시오. 그런 다음, 이 키트로부터 밀리리터당 200 나노그램으로 희석제로 희석제로 희석제로서 희석제로서 희석제로 희석제를 희석시키고 P24 ELISA 희석 표에 따라 1.5밀리리터 튜브의 표준 곡선에 대한 희석제를 만듭니다. 시료 내의 바이러스의 농도를 측정하기 위해 1:1000 희석부터 시작하여 96웰 플레이트의 지정된 우물에 샘플 희석을 추가하고 표준 곡선의 범위 내에 있기 위해 필요에 따라 부피를 수정한다.
그런 다음 트리톤 X-100으로 샘플을 0.5%의 최종 농도로 희석하고 각 샘플의 200 마이크로리터와 RPMI 1640을 지정된 우물에 추가합니다. 접시를 밀봉하고 2 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 1X 세척 버퍼의 웰 당 300 마이크로 리터로 접시를 6 번 세척하십시오.
접시를 반전하고 종이 타월에 눌러 여분의 액체를 제거합니다. 그런 다음 기판 공백을 제외한 모든 우물에 키트에서 검출기 항체 100 마이크로리터를 추가합니다. 접시를 밀봉하고 1 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오.
접시를 씻은 다음 접시를 반전시키고 종이 타월에 두드려 여분의 액체를 제거하십시오. 검출기 항체를 측정하기 위하여는, SA-HRP 희석으로 1:100 희석에서 스트렙타비딘 고추냉이 과옥시다아제를 희석시 희석한다. 희석된 SA-HRP를 완전히 혼합하고 빈 을 제외한 모든 우물에 100 마이크로리터를 추가합니다.
플레이트를 실온에서 30분 동안 밀봉하고 배양합니다. 다음으로, 1X 세척 버퍼로 접시를 씻고 여분의 액체를 두드리고. 1개의 직교-페닐렌디아민 정제를 1플레이트에 충분한 기질 용액을 만들기 위해 기질 희석제의 11밀리리터에 떨어뜨립니다.
완전히 용해하고 빛으로부터 보호하기 위해 적극적으로 OPD 솔루션을 소용돌이. 빈 공간을 포함한 모든 웰에 OPD 기판 용액 100마이크로리터를 추가합니다. 분광계를 사용하여 450 나노미터에서 즉시 흡광도를 읽습니다.
1초 간격으로 10회 반복하고 평균 측정을 수행합니다. 폴리브레네를 가진 감소된 혈청 매체의 5밀리리터에 있는 백만 세포의 밀도를 가진 T75 플라스크에 있는 Jurkat T 세포를 재중단하고 배양합니다. 그런 다음 백만 dCas9 함유 바이러스 입자를 포함하는 HEK293T 조건부 미디어를 추가합니다.
이산화탄소5%로 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 3 일 감염 후, 5 분 동안 233 시간 g에서 세포를 회전하고 puromycin으로 보충 된 완전한 DMEM의 10 밀리리터에서 다시 중단하십시오. T75 플라스크의 세포를 배양하고 이산화탄소 5%로 섭씨 37도에서 배양합니다.
9 일 동안 매 셋째 날마다, 5 분 동안 233 배 g에서 세포를 회전하고 puromycin로 보충 된 완전한 DMEM으로 미디어를 대체합니다. 혈전계 또는 자동화된 세포 카운터를 사용하여 세포를 계산합니다. 이어서, 조직 배양 조직으로 96웰 플레이트에, 첫 번째 우물에서 푸오마이신으로 보충된 완전한 DMEM의 100 마이크로리터에 10, 000세포를 첨가한다.
푸오마이신으로 보충된 완전한 DMEM으로 다음 우물의 내용물을 1:1 연속 희석합니다. 이산화탄소5%로 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 클론 의 세 에 대한 6 웰 플레이트의 웰 당 2 백만 개의 세포를 판두 24 웰 플레이트로 복제 세포를 확장합니다.
비 변형 된 Jurkat 세포와 다른 세 개의 우물을 컨트롤로 플레이트. 마지막으로, 세포를 T75 플라스크로 플레이트하고 세포를 세포 배양 인큐베이터에 하룻밤 동안 넣습니다. 유전자 발현을 측정하기 위해 먼저 RNA 1마이크로그램, cDNA 합성 완충제 4마이크로리터, 250마이크로리터 튜브에 역전사 1마이크로리터를 추가하여 보완 DNA를 합성한 다음, 20마이크로리터의 최종 부피에 물을 추가합니다.
그런 다음, 42섭씨에서 30분 동안, 95도에서 5분간 열 순환기를 사용하여 역방향 전사를 비활성화합니다. 합성 후 60 마이크로리터의 물로 cDNA를 희석시보시다. 10 마이크로몰라의 최종 농도에서 각 전방 및 역 프라이머의 0.5 마이크로리터를 포함하는 튜브에 대한 폴리머라제 연쇄 반응을 실행, SYBR 녹색의 5 마이크로리터, 및 cDNA의 4 마이크로 리터.
마지막으로 10 일 동안 Hygromycin B로 보충 DMEM에서 Jurkat-dCas9 세포를 선택합니다. 세포를 회전하고 3 일마다 미디어를 변경합니다. RNA를 정화하고 RT-qPCR로 진행합니다.
본 연구에서는, 전사 시작 부위로부터 10~100개의 염기 쌍 내에 있던 gRNA 서열은 염증성 장 질환과 관련된 긴 비코딩 RNA인 IFNG-AS1의 전사 궤적에 Cas9 활성화 복합체를 지시하는 데 사용되었다. 이중 변환 된 세포의 선택을 가능하게 하기 위해, 2-plasmid 시스템은 세포로 dCas9 또는 gRNAse 증강을 변환하는 데 사용되었다. 여기서 MS2 단백질은 IFNG-AS1의 과발현을 향상시킵니다.
Cas9 발현은 두 클론모두에 대해 확인되었다. HPRT1에 대한 프라이머는 비트랜스유도 된 세포에서 RNA의 존재를 확인하는 데 사용되었다. mRNA 발현은 cDNA 반응으로부터 역실체를 생략하여 확인되었다.
IFNG-AS1의 3개의 스플라이스 변이체는 알려진 모든 IFNG-AS1 성적증명서에 대해 전사체별 프라이머 세트 또는 프라이머 세트로 검출될 수 있다. 모든 형광 곡선은 제어 와 IFNG-AS1 gRNA 표현 세포 사이의 반 주기 내에서 지수 단계에 도달 하는 하우스키핑 유전자 HPRT1기만하급수적 이었다. 알려진 모든 IFNG-AS1 성적증명서에 대한 프라이머는 IFNG-AS1 발현에서 20배 증가의 측정과 함께 실험 간에 가장 검출가능한 것으로 나타났다.
그러나 IFNG-AS1의 세 번째 성적증명서는 IFNG-AS1 수준에서 5-10배 의 유의한 증가를 보였다. 원하는 유전자를 적극적으로 과장하기 위해 2.1 단계에서 가이드 RNA의 설계는 프로토콜의 성공에 매우 중요합니다. 또한 고품질 바이러스 입자를 생산하면 프로토콜 구성 요소를 강력하게 표현할 수 있습니다.
일단 원하는 유전자가 과발현되면, 기능성 연구는 유전자 기계장치를 조사하기 위하여 수행될 수 있습니다. 우리의 예에서, 우리는 관심의 유전자의 과발현에 따라 사이토카인 생산을 보기로 결정했습니다. 이 기술은 처음에 2013년에 Griesbach Group에 의해 개발되었으며 다른 그룹에서 광범위하게 적용되고 정교해졌습니다.
우리는 그들의 특정 기능을 탐구하기 위해 긴 비코딩 된 RNA에이 기술을 적용하는 것을 기쁘게 했다. 복제 결함이 있는 렌즈바이러스는 바이러스 성 작업에 대해 승인된 실험실에서 처리되어야 합니다. 추가적으로, 인간 적인 세포주 및 E.coli 박테리아는 생물적인 유해한 여겨집니다.
마지막으로, 재조합 DNA 플라스미드는 훈련된 직원에 의해 처리되어야 합니다.
