이 방법은 폐 내의 염증성 유전자를 조절할 것으로 예상되는 microRNAs의 발현을 평가하는 방법에 대한 폐 면역 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 폐 microRNA 발현에 순환 호르몬의 기여를 확인하는 간단한 방법을 제공합니다. 에스트라스트 사이클 스테이지를 평가하기 위해 8~9주된 암컷 마우스를 수동으로 억제하고 매우 순수한 물로 채워진 플라스틱 10 마이크로리터 파이펫의 끝을 질에 도입합니다.
샘플을 수집하기 위해 4~5회 부드럽게 세척하고 질 액의 최종 플러시를 유리 슬라이드에 증착합니다. 그런 다음 20배 배율에서 광 현미경으로 얼룩지지 않은 질 플러시를 관찰한다. 오존 및 여과된 공기 노출의 경우 와이어 메쉬 뚜껑이 있는 2개의 개별 1.2 리터 유리 용기 중 하나에 최대 4마리의 마우스를 배치합니다.
오존 챔버에 유리 용기 1개를 넣고 1개를 여과된 공기 노출 챔버에 넣습니다. 그런 다음 오존 농도를 백만 개당 2 부로 조정하여 3 시간 후에 용기를 제거합니다. 노출 후 4시간 후, 첫 번째 실험 마우스의 노출된 피부 표면을 70%에탄올로 소독하고 흉곽을 잘라 심장과 폐를 노출시합니다.
집게를 사용하여 액체 질소에 1.5 밀리리터 RNase 가없는 마이크로 원심 분리기 튜브를 침수하고 액체 질소에서 수확 된 폐를 동결합니다. 그런 다음 스테인레스 스틸 조직 분쇄기를 사용하여 전체 폐를 마스레이트하고 분쇄 된 조직을 두 개의 1.5 밀리리터 미세 원심 심분리기 튜브 로 분할합니다. 모든 동물로부터 폐를 수확하고 분쇄한 후 각 시료에 500 마이크로리터를 추가하고 각 시료에 18, 21 및 23 게이지 바늘로 각 조직을 순차적으로 균질화합니다.
마지막 균질화 후, 15 초 동안 소용돌이전에 각 샘플에 에탄올의 500 마이크로 리터를 추가합니다. 원심분리를 위해 개별 수집 튜브의 개별 스핀 컬럼에 혼합물을 적재하고 흐름흐름을 폐기합니다. DNase 1 처리를 위해, 또 다른 원심분리를 위해 각 컬럼에 400 마이크로리터의 RNA 세척 버퍼를 추가하고 RNase 가 없는 관에 있는 견본 당 DNA 소화 완충제의 5개의 마이크로리터를 혼합합니다.
실온에서 15분 간 배양하기 위해 컬럼 행렬에 직접 믹스를 추가한 다음 400마이크로리터 RNA 세세척 용액 2개를 원심분리로 씻어낸다. RNA를 elute하기 위하여는, 최종 원심분리를 위해 각 컬럼 매트릭스에 DNase RNase 가 없는 물의 35 마이크로리터를 추가하고, 분광광계에 각 견본의 총 RNA 농도 그리고 순도를 측정합니다. 그런 다음 RNA를 영하 80도에서 저장합니다.
작은 RNase의 레트로 전사를 위해, 샘플 당 역 전사 반응 혼합의 한 튜브에 전세 용액의 10 마이크로 리터에 총 RNA의 200 나노그램을 추가합니다. 혼합 후 샘플을 잠시 원심분리하고 잠큐어때까지 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 37°C에서 60분 동안 튜브를 배양하고, 95도에서 5분간 배양합니다.
두 번째 인큐베이션의 끝에서, 20 마이크로리터 역전사 반응 당 RNase 가없는 물의 200 마이크로 리터로 CDNA를 희석하고, 전하 마우스 염증 반응 및 자가 면역 microRNA PCR 어레이의 각 웰에 각 반응 믹스 샘플의 10 마이크로 리터를 추가합니다. 프로스테루스 단계는 둥근 모양과 잘 형성된 핵상피세포의 존재에 의해 규명될 수 있다. 마우스가 에스루아 단계에 있을 때, 모체, 옥수수, 편평상피 세포의 조밀하게 포장된 클러스터가 얼룩에서 관찰된다.
메테루스 동안, 옥수수 상피 세포와 다형성 백혈구가 보입니다. diestrus에서, 백혈구는 일반적으로 더 널리 퍼집니다. 4개의 마우스 폐에서 추출된 RNA는, 입증된 바와 같이, 마이크로리터 당 1198에서 2178 나노그램 사이에 구역 수색하는 핵산 농도를 나타내고 평균 A260 에서 A280 비율은 2.01과 2.02 사이, 평균 A260 에서 2.139와 2.223 사이의 비율을 나타낸다.
이 표에서, 오존과 여과된 공기 노출 마우스 사이의 마이크로RNA 발현의 2배 변화를 기록한다. 14 마이크로RNA에 대한 microRNA 표적 필터 및 코어 분석 후, 상당한 발현 로그 비율 및 P 값을 얻기 위해, 이러한 데이터는 microRNA 표적 필터에 의해 매핑될 수 있다. 핵심 분석은 또한 표준 경로, 질병 및 기능, 규제 기관 및 네트워크에 대한 정보를 제공합니다.
또한, 기능 분석 소프트웨어는 관심있는 microRNA와 다른 분자 사이의 관계를 보여주는 네트워크 분석을 생성하는 데 사용될 수 있다. 이 절차를 시도하는 동안, 실험을 수행하기 전에 적어도 3 개의 연속 사이클에 대 한 매일 estrus 주기를 확인 하는 것이 중요 하다. 이 절차에 따라, 다른 방법은 estrus 주기에 걸쳐 폐 염증 성 유전자 발현에 대한 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다.
개발 후, 이 기술은 폐 면역 분야의 다른 연구자들이 다른 모델을 사용하여 성 호르몬 조절 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
