이 프로토콜은 균균 감염 중 대식 세포 사멸 모드를 명확하게 구별 할 수 있습니다. 여러 배아를 병렬로 관찰함으로써 전체 대식세포 세포 사멸 과정을 포착할 확률을 크게 증가시킨다. 이 프로토콜은 또한 감염 또는 멸균 염증을 관련시키는 유사한 시나리오에서 세포 사멸 및 그밖 세포 행동의 관찰에 적용될 수 있습니다.
확장 된 라이브 이미징 동안, 광표백 및 독성을 피하기 위해 가능한 한 낮은 레이저의 강도를 유지하는 것이 매우 중요합니다. 원고에 따라 접종 후, 원심 분리는 10 분 동안 3000 배 G에서 문화를 원심분리하여 진균 마리넘을 펠릿으로 수집합니다. 상류체의 300 마이크로리터를 제외한 모든 것을 버리고 펠릿을 다시 중단합니다.
7H9 배지 3밀리리터를 10%의 글리세롤을 추가하여 펠릿을 다시 정지한 다음 100와트의 수조에서 서스펜션을 초음파 처리하여 15초, 15초 를 끄고 총 2분 동안 단일 세포 균질을 달성합니다. 세균 현탁액을 10 밀리리터 주사기로 옮기고 5미크론 필터를 통과하여 세균 덩어리를 제거합니다. 분광계를 사용하여 서스펜션의 광학 밀도를 측정하고 10% 글리세롤을 함유한 7H9 매체로 희석하여 OD 600에 1을 희석한다.
서스펜션을 10마이크로리터 알리쿼트로 나누고, 추가 사용을 위해 섭씨 80도에 보관하십시오. 첫째, 아가로즈를 완전히 녹을 때까지 섭씨 95도 의 가열 블록으로 가열합니다. 아가로즈를 액체 형태로 유지하여 섭씨 45도 의 가열 블록에 배치하십시오.
트렁크 부위의 근육 내 감염을 위해 장착하려면, 유리 슬라이드에 균등하게 아가로즈에 의해 1%의 중량 1%의 0.5 밀리리터를 부어 하부 아가로즈 층을 만듭니다. 슬라이드를 얼음 상자 또는 차가운 표면에 3 분 동안 배치하여 고화시합니다. 제브라피시 배아를 마취한 후, 최대 60마리의 제브라피시 배아를 바닥 아가로즈 층에 놓고 두 줄로 조심스럽게 배치합니다.
티슈 페이퍼로 바텀 아가로즈 층에 남은 물을 제거하고, 0.3 밀리리터를 부피아가로즈에 추가하여 상층을 생성한다. 배아가 아가로즈에 완전히 내장되어 있는지 확인하십시오. 유리 슬라이드를 얼음 상자에 다시 반환하여 아가로즈를 고화시합니다.
여분의 E3 달걀 물로 표면을 덮어 아가로즈 의 상단 층을 촉촉하게 유지합니다. 다음으로, 미세 주입기 및 미세 조작기를 미세 주입에 대한 적절한 위치 및 설정으로 조정합니다. 마이크로 로더를 사용하여 준비된 세균 배양 3개의 마이크로리터를 준비된 바늘로 옮기.
파이펫은 기포가 형성되지 않도록 천천히 조심스럽게. 트렁크 영역에 100 CFU를 주입합니다. 미세 주입 후 얼룩말 물고기 배아를 플라스틱 파이펫으로 신선한 달걀 물에 조심스럽게 씻어 넣습니다.
중뇌 감염을 위해 마운트하려면 플라스틱 파이펫을 사용하여 4-6개의 트리카인 마취 배아를 아가로즈로 옮겨 넣습니다. 각 배아의 머리를 10 게이지 바늘로 조심스럽게 위쪽으로 놓습니다. 모든 배아 위치가 고정되면 유리 슬라이드를 얼음 상자 또는 차가운 표면으로 옮겨 아가로즈가 고화하게 합니다.
중뇌에 500 CFU를 주입하십시오. 미세 주입 후, 조심스럽게 플라스틱 파이펫신선한 계란 물에 제브라 피시 배아를 플러시. 아가로즈가 완전히 굳어지면 아가로즈를 달걀 물 층으로 덮습니다.
환경 챔버를 설치 한 후, 환경 챔버에 제브라피시와 35 밀리미터 유리 바닥 접시를 배치합니다. 405 다이오드, 20%의 힘으로 아르곤, DPSS 561 나노미터 레이저를 엽니다. 스펙트럼 설정에서 적절한 레이저 전원을 설정합니다.
XYZ 순차 스캔 획득 모드를 선택하고 이미지 형식을 512x 512픽셀로 설정합니다. 라이브 데이터 모드로 전환하고 첫 번째 제브라피시의 위치를 타겟팅하고 시작 및 끝 Z 위치를 표시합니다. 나머지 배아 각각에 대해 이 과정을 반복한다.
프로그램 끝에 일시 중지를 추가합니다. 프로그램의 루프 및 주기를 정의하고 파일을 저장합니다. 이 연구에서는, 우리는 이전에 보고된 형질형 coro1a:eGFP;lyzDsRed2, 및 형질형 mpeg1loxP;DsRed:loxPeGFP;lyz:eGFP를 활용하여 생체내 의 대식세포와 호중구를 구별했습니다.
박테리아로 무겁게 채지는 대식세포는 둥글게 되었고, 최종 세포질 팽윤, 세포막 파열, 세포질 함량의 빠른 보급과 함께, 감소된 운동성을 표시하였다. UV 조사 대식세포는 세포 수축, 핵 분열 및 크로마티닌 응축과 같은 전형적인 세포 표현형을 보였다. 또한 대식세포가 활발하게 식세포화및 M.메리눔을 전파하는 것을 관찰했다.
그러나, 호중구는 식세포 기능을 제한하고, 명백한 세균성 engorgement 없이 빨리 lytic 세포 죽음을 겪었습니다. 강력한 유전자 편집 도구와 결합된 이 프로토콜은 생체 내의 숙주 병원체 상호 작용에 대한 다양한 요인의 효과를 더 잘 이해할 수 있는 효과적인 플랫폼을 제공할 수 있습니다.
