혈관 성형술은 관상 동맥 질환을 가진 환자를 돕지만, 심혈관 사건은 여전히 절차 후에 발생할 수 있습니다. CPC와 수용성 분자가 관상 동맥 순환에서 얻어지므로 혈관 손상 및 수리 정도와 상관관계가 있을 수 있습니다. 관상 동맥 MPC 및 수용성 중재자 수준은 그러므로 관상 동맥 혈관 성형술을 겪고 있는 관상 동맥 질병을 가진 환자에 있는 심장 혈관 사건 및 예후를 추정하기 위하여 이용될 수 있습니다.
MPC 및 수용성 분자는 또한 재발사지 허혈성 치기와 같은 다른 허혈성 조정에서 생기는 합병증 및 예후를 추정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 에두아르도 베라 고메즈와 알레한드로 에르난데스-파트리시오, 실험실 기술자, 카렌 드 라 베가 모레노, 카를로스 자모라-알레만, 학부 생학생이 될 것입니다. 또한 가브리엘라 알렉산드라 도밍게즈 페레즈, 과학 학생의 석사, 알베르토 멜코르 로페즈, 박사 과정 학생, 마리오 안토니오 텔레즈 곤잘레스, 과학 협력자 의 석사입니다.
수집 1 시간 이내에 수확 된 혈액 샘플의 6 밀리리터를 15 밀리리터 원뿔 관으로 옮기고 PBS에서 1 대 1 비율로 혈액을 희석시하십시오. 밀도 그라데이션 배지 2밀리리터를 3개의 시험관에 추가하고 희석된 혈액의 3개의 동일한 알리쿼트를 각 밀도 그라데이션 배지 튜브에 조심스럽게 전달합니다. 원심분리로 세포를 분리하고 인터페이스에서 세포를 새로운 튜브로 옮긴다.
수집된 세포를 PBS 2밀리리터에서 6분간 1회 세척한 후, 2분간 세척당 신선한 PBS 2밀리리터로 6개의 세척을 세척합니다. 마지막 세척 후, 계산을 위해 PBS의 1 밀리리터에 MPC 함유 세포 펠릿을 다시 중단하고 5 밀리리터 유동 세포 측정 튜브에 1회 10을 추가한다. 원심분리에 의해 세포를 펠렛하고 각 튜브에 항체 배양 용액에 희석된 적절한 관심 항체의 100 마이크로리터를 첨가한다.
세포를 추가한 항체 칵테일과 10초 간 부드럽게 섞고, 샘플을 빛으로부터 보호한 섭씨 4도에 20분간 배치합니다. 인큐베이션의 끝에서, 원심 분리하고 2 밀리머 EDTA로 보충 PBS의 500 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단. 등색성 일치 컨트롤을 사용하여 배경 염색을 설정하고, 표준 프로토콜에 따라 혈류 세포측정에 의해 샘플을 분석하고, 나란히 분산 된 플롯으로 앞으로 림프구를 게이팅하여 잔류 과립구, 세포 이물질 및 기타 입자를 배제합니다.
CD45 양성 CD34 양성 표현형을 가진 많은 수의 세포를 포함하는 게이트를 설정합니다. 다음으로, CD45 양성 CD34 양성 게이트를 사용하여 키나아제 삽입 도메인 수용체 CD133 또는 CD184 양성 세포를 선택한다. MPC 하위 모집단은 특정 세포 표면 마커에 의해 식별되고 게이트된 이벤트의 백분율로 보고될 수 있습니다.
수집된 혈액 샘플에서 수용성 바이오마커의 농도를 결정하기 위해 먼저, 키트 제공 세척 버퍼로 적절한 미리 코팅된 ELISA 플레이트를 두 번 세척하고 표준, 시료 및 제어 튜브에 라벨을 부착한다. 혈액 샘플을 원심분리하여 혈액 성분을 분리하고 혈장들을 샘플 튜브로 알리쿼트합니다. 표준, 샘플 및 컨트롤을 적절한 우물로 옮기고 플레이트를 90분 동안 섭씨 37도에서 인큐베이션합니다.
인큐베이션의 끝에서, 우물 내용을 버리고 각각의 우물에 비오틴 검출 항체를 추가한다. 섭씨 37도에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 접시 내용물들을 버리고 세척당 신선한 세척 버퍼로 우물을 세 번 씻습니다. 마지막 세척 후, 입증 된 바와 같이, 37섭씨37도에서 30 분 동안 스트렙타비딘 작업 용액으로 샘플을 배양하고 세 세척.
마지막 세척 후, 37섭씨에서 30분 동안 테트라메틸벤지딘 기판으로 샘플을 치료하십시오. 색상이 개발되면 키트에서 정지 용액을 추가하고 마이크로 플레이트 ELISA 판독기에서 광학 밀도 흡광도를 읽습니다. 종양 괴사 인자 알파및 인터류킨-1 베타의 농도를 결정하기 위해 면역자기 멀티플렉스를 사용하여 표준, 샘플 및 제어 튜브에 라벨을 부착하고 자기 비드 바이알을 30초 동안 소용돌이시다.
멀티플렉싱 분석 플레이트의 적절한 웰에 구슬을 추가합니다. 모든 구슬이 추가되면 핸드헬드 마그네틱 플레이트 와셔를 단단히 삽입하고 구슬이 각각의 바닥에 축적될 때까지 2분 정도 기다린 후 핸드헬드 마그네틱 플레이트 와셔와 플레이트 어셈블리를 폐기물 용기 위에 신속하게 반전시한다. 다음으로, 각 우물에 150 마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하고 30초를 기다려야 구슬이 바닥에 축적될 수 있도록 합니다.
방금 설명한 대로 내용을 다시 폐기하고 준비된 표준, 샘플 및 컨트롤의 25 마이크로리터와 범용 분석 버퍼 25 마이크로리터를 추가합니다. 플레이트를 실내 온도에서 빛으로부터 보호하고 분당 500회 회전하여 최소 60분 간 배양할 수 있습니다. 인큐베이션이 끝나면 각 웰에 150 마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하고 구슬이 30초 동안 정착할 수 있도록 합니다.
이어서, 플레이트 와셔를 사용하여 잘 내용물들을 버리고 각각 25마이크로리터의 검출 항체 혼합물을 잘 표시하고, 2개의 세척을 선행하여 입증한다. 두 번째 세척 후, 실온에서 30 분 동안 스트렙타비딘 PE의 25 마이크로 리터와 샘플을 배양. 인큐베이션이 끝나면 각 우물에 120마이크로리터의 판독 버퍼를 추가하고 실온에서 빛으로부터 보호되는 5분 간 플레이트를 밀봉하여 분당 500회 회전합니다.
그런 다음, 멀티플렉스 분석 판독기에 플레이트를 로드하고 각 분석체에 따라 판독 매개 변수를 조정합니다. 관상 동맥, 금성 부비동 및 말초 혈액은 관상 동맥 혈관 조영술을 받은 52명의 환자로부터 수집되었으며 고혈압과 이상지질혈증의 높은 유병률을 입증하였다. 대부분의 MpC의 기준선 관상 동맥 농도는 MPC 하위 집단 CD34 양성 CD133 양성, CD45 양성, CD34 양성, CD133 양성, CD184 양성에서 더 큰 감소와 함께, 주요 불리한 심장 혈관 이벤트를 개발 한 환자에서 상당히 낮았다.
마찬가지로, 주요 불리 한 심장 혈관 이벤트를 개발 하는 환자는 수용 성 ICAM-1의 관상 동맥 금액에 증가 기준선 및 금속 로 매트릭스 단백질의 낮은 금액 9. 관상 동맥 MPC및 수용성 ICAM-1은 주요 불리한 심장 혈관 이벤트 없는 생존을 위한 예후 능력을 보여주었습니다. 흥미롭게도, 종양 괴사 인자 알파의 발현은 동일한 관상 동맥에서 상이한 루멘 영역의 비교에 기초하여 측정 시간 및 관상 동맥 샘플링의 위치에 따라 변이를 시연하여 내래 초음파를 사용한다.
MPC 격리 하는 동안, 밀도 그라데이션에 혈액을 전송 하 고 원심 분리 후 인터페이스에서 세포를 수집 해야 합니다. 주기적인 소용돌이는 비드 강수량을 방지하고 마그네틱 플레이트 와셔를 사용하면 세척 중에 구슬을 우물 안에 보관하는 데 도움이 됩니다. 관상 동맥 MPC 및 수용성 분자는 혈관 성형술 후 후속 시 심혈관 이벤트의 위험을 계층화하는 데 유용하며,이 기술은 용액 의 중단 중에 발생하는 병리학 적 과정을 반영하기 때문에 고위험 개인에게 이차 예방을 제공하는 데 도움을 주며 혈관 생물학이 역할을하는 조건에 유용 할 수 있습니다.
