이 방법의 전반적인 목적은 단일 세포와 인구 수준에서 모두 세균 세포에 대한 스트레스 치료의 효과를 분석하는 것입니다. 그것은 세포 생존가능성, 형태학 및 DNA 함량을 포함하여 세균성장의 몇몇 양상에 응력의 효력의 글로벌 비전을 제공합니다. 또한 인구 회복을 특성화할 수 있습니다.
이 방법은 제약 산업에서 새로운 항균 분자의 활성을 선별하고 박테리아 생존력과 성장에 미치는 영향을 높이 평가할 수 있습니다. 스트레스를 유발하는 치료는 복용량 및 시간에 따라 비효율적입니다. 이 프로토콜을 시작하기 전에 최적의 용량과 치료 기간을 결정하기 위해 예비 검사를 실행해야 할 수도 있습니다.
이 방법의 시각적 데모를 사용하면 각 중요한 단계와 제대로 수행하는 방법에 대한 중요한 세부 사항을 볼 수 있습니다. 우선, E.Coli MG1655 HU-PAmCherry의 단일 콜로니콜로 MOPS EZ 리치 정의 매체의 5 밀리리터를 접종하고 하룻밤 동안 분당 140 회전에서 흔들림과 함께 섭씨 37도에서 성장한다. 다음 날 아침, 시료 100마이크로리터를 추출하여 900마이크로리터의 매체로 희석하여 600나노미터의 광학 밀도를 측정하였다.
이어서, 0.01의 OD600 나노미터에 신선한 배지를 함유하는 시험관에서 배양을 희석한다. 광학 밀도가 0.2에 도달할 때까지 140 RPM에서 흔들림과 함께 37°C에서 접종된 시험관을 배양하여 풍부한 매체의 전체 지수상에 해당합니다. 그런 다음 시간 경과 현미경 검사기 이미징, 희석 및 도금 분석, 유동 세포 분석 및 현미경 스냅샷 이미징을 위한 배양 샘플을 알리쿼트합니다.
시험관에서 세포 배양의 나머지 4.4 밀리리터를 특정 스트레스 치료에 노출시한다. 예를 들어, 밀리리터 당 5 마이크로그램에서 셀렉신의 4.4 마이크로리터와 140 RPM에서 흔들림과 함께 섭씨 37도에서 배양. 신선한 배지에서 배양 샘플 200마이크로리터 중 최대 10배에서 마이너스 7분의 1의 10배 의 직렬 희석을 준비한다.
매우 부드러운 소용돌이또는 튜브를 반전하여 각 희석 사이에 혼합합니다. 선택되지 않은 LB 아가로즈 플레이트에 적절한 희석제 100 마이크로리터를 플레이트하고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 각 배양 샘플에서 실행 가능한 세포의 농도를 결정하기 위해 식민지 수를 계산합니다.
치료되지 않고 처리된 세포 배양에 대한 시간의 함수로서 밀리리터당 CFU를 플롯합니다. 분광계에서 배양의 OD600을 측정합니다. 배양 샘플을 섭씨 4도에서 신선한 배지로 희석하여 0.06에서 OD600을 가진 샘플을 얻어 마이크로리터 당 약 15, 000 세포에 해당합니다.
DNA 염색의 경우 희석된 세균 샘플을 1대 1의 부피 배급시 DNA 형광염의 밀리리터 용액당 10 마이크로그램과 혼합하고 15분 동안 어둠 속에서 배양한다. 시료를 주입하기 전에 매우 부드러운 소용돌이또는 튜브를 반전시켜 샘플을 섞는다. 분당 약 120, 000 세포의 유속으로 시토미터로 샘플을 전달한다.
적절한 설정으로 DNA 형광염 염료/형광 신호뿐만 아니라 전방 산란 및 측면 산란 광을 획득하십시오. 세포 크기의 분포를 나타내기 위해 전방 산란 세포 밀도 히스토그램을 플롯하고 DNA 형광염 제염/형광 신호 세포 밀도를 플롯하여 세포 집단내 DNA 함량을 나타낸다. 먼저 온도 안정화를 위해 온도가 37도에서 열성 현미경 챔버를 예열합니다.
원고에 설명된 대로 아가로즈 장착 슬라이드를 준비합니다. 현미경 단계에 슬라이드를 배치하고 mCherry에 대한 560 나노미터에서 얼굴 대비 목표를 가진 송신 광을 사용하여 이미지 수집을 수행합니다. 이미지 분석 중에 자동화된 셀 검출을 용이하게 하기 위해 격리된 셀을 포함하는 뷰 필드를 선택합니다.
세포 집단의 강력한 통계 분석을 허용하기 위해 적어도 300개의 세포가 이미지화되는지 확인하십시오. 먼저, 미세유체 판에서 보존 용액을 제거하고 미세 유체 소프트웨어 사용자 가이드에 설명된 대로 섭씨 37도에 예열된 신선한 배지로 교체한다. 미세 유체 플레이트를 매니폴드 시스템에 부착합니다.
그리고 미세 유체 소프트웨어에서, 매니 폴드 시스템에 접시에 밀봉 씰 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 프라이밍 버튼을 클릭합니다. 현미경 단계에 매니폴드 시스템으로 미세 유체 플레이트를 배치하고 미세 유체 챔버의 팽창을 피하기 위해 2 시간 동안 섭씨 37도에서 예열하십시오.
씰 오프 버튼을 클릭하여 미세 유체 시스템의 미세 유체 플레이트를 밀봉합니다. 배지를 배양 시료 150마이크로리터로 잘 8개에서 교체하고 응력 유도 시약의 유무에 관계없이 배지를 1~5마이크로리터로 교체한다. 미세 유체 플레이트를 밀봉하고 현미경 단계에 배치합니다.
미세 유체 소프트웨어에서 셀 로딩 프로시저를 실행합니다. 세포의 적재가 전달된 빛에서 현미경으로 보고 만족스하 인지 확인합니다. 조심스럽게 전송 된 빛 모드에 초점을 맞추고 고립 된 박테리아를 보여주고 혼잡하지 않는 보기의 여러 필드를 선택, 100 평방 마이크로 리터 당 약 10 ~ 20 세포.
미세 유체 소프트웨어에서 사용자 지정 시퀀스 실행 버튼을 클릭한 다음 2 PSI에서 10 분 동안 스트레스 유도 매체의 주입을 프로그래밍한 다음 스트레스 치료의 원하는 기간 동안 하나의 PSI에서 주사를 처리합니다. 필요한 경우 mCherry 신호에 대한 투하 광원및 560 나노미터 의 발광 광원을 사용하여 10분마다 한 프레임씩 타임랩스 모드에서 현미경 이미징을 수행합니다. 현미경 이미지 수집 및 미세 유체 주입 프로토콜을 동시에 시작합니다.
피지 소프트웨어와 미생물 플러그인을 엽니 다. 스냅샷 분석을 위해 현미경 슬라이드 1개에 해당하는 모든 이미지를 MicrobeJ 로딩 바에 놓아 이미지를 연결하고 획득한 이미지 스택 파일을 저장합니다. 시간 경과 데이터의 경우 이미지 스택을 MicrobeJ의 로딩 막대에 놓기만 하면 됩니다.
위상 대비 영상의 세분화에 기초하여 세포의 윤곽을 자동화하여 실행하고 스테인드 DNA 형광 신호의 세분화에 기초하여 핵의 검출을 실행한다. 세포 검출의 정확성을 시각적으로 확인하고 필요한 경우 MicrobeJ 편집 도구를 사용하여 교정하십시오. 얻은 결과 파일을 저장합니다.
아이콘 ResultJ를 클릭하여 분석을 완료하고 ResultJ 창을 가져옵니다. 다양한 유형의 출력 그래프가 생성됩니다. 세포 형상 또는 길이의 정규화된 히스토그램을 플롯하고 세포당 핵수를 의미한다.
이 연구는 세포 분열을 특히 억제하는 항생제인 세플렉신에 일시적인 노출 시 대장균 K-12 세포의 행동을 분석했다. 세플렉신의 존재에서 성장하는 세포 배양은 스트레스없는 배양으로 유사한 OD600 증가를 나타냈다. 셀렉스신이 존재했을 때 실행 가능한 세포의 농도는 증가하지 않았다.
세포는 세플렉신이 제거되고 결국 2 시간 후에 스트레스없는 문화에 상응하는 농도에 도달했을 때 다시 나누기 시작했습니다. 다른 응력은 유도된 효과에 따라 밀리리터 곡선당 OD 및 CFU의 다른 분리를 초래했습니다. 세플렉신에 노출은 세포 크기와 DNA 내용의 병렬 증가를 불러 일으켰다.
세플렉신이 제거되었을 때, 인구 세포 크기와 DNA 함량은 점차 감소하고 2 시간 후에 스트레스되지 않은 인구와 유사하게되었다. 세플렉신은 정상 세포 폭을 가진 긴 세포의 형성을 자극한 다음 분열 격막이 없습니다. 정량적 이미지 분석은 세포 크기 및 DNA 함량 증가를 확인했습니다.
시간 경과 이미지는 세포 신장 및 염색체 복제 및 분리가 세플렉신에 노출되어 억제되지 않았다는 것을 확인합니다. 필라멘트 세포 혈통의 분석은 세포 분열이 약을 씻은 후에 대략 20 분 다시 시작되었다는 것을 보여주었습니다. 세균성 인구가 스트레스 치료를 유도하기 전에 전체 기하급수적인 성장에 있는지 확인하는 것이 중요합니다.
이러한 접근에 사용되는 스트레스 유도 치료는 유독성 화합물과 같은 실험에 위험할 수 있습니다. 그래서 조심스럽게 화합물을 처리하고 장갑, 마스크, 고글, 실험실 코트를 착용하십시오.
