우리의 프로토콜은 그들의 희소한, 적색 이동 상태를 사용하여 초해상도 현미경 검사법에 대한 기존의 BODIPY 염료의 사용을 설명합니다. 이를 통해 30나노미터 해상도로 살아있는 세포에서 세포기관과 생체 분자를 연구할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 단일 분자 신호의 오래 지속되는 소스를 제공하는 다양한 BODIPY 컨쥬게이트의 단순성과 다재다능함입니다.
우리의 입증 된 응용 프로그램은 회절 한계 이하의 지질 방울과 지방산을 해결하여 지방 간 질환이나 타입-2 당뇨병과 같은 질병에 대한 통찰력을 얻는 것이 중요해질 수 있습니다. 우리는 효모와 포유류 세포에서 지방산과 지질 물방울 생물학에 대한 통찰력을 얻습니다. 그러나,이 기술은 낮은 배경 형광을 가진 다른 모든 투명 세포 유형에 적용 할 수 있습니다.
처음으로 기술력을 사용하는 경우, 밝은 단일 분자 신호를 관찰하기 위해 디 농도와 레이저 능력을 최적화해야합니다. 이 기술의 시각적 데모는 레이저 전력의 디 농도 및 최적화가 밝은 단일 분자 신호를 어떻게 초래하는지 확인하는 것이 중요합니다. 비형성 DMBM에서 포유류 U2OS 세포를 10%의 태아 소 혈청 4밀리머 글루타민, 1밀리머 나트륨 피루바테, 그리고 T-25 플라스크에서 페니실린 연쇄절제술 항생제 1%를 유지한다.
셀을 70~80%로 1~5개, 파이펫을 8개의 웰 플레이트의 단일 웰에 분배합니다. 12 ~24시간 동안 8개의 웰 플레이트에 있는 세포를 변경합니다. 이미징하기 10분 전에 BODIPY-C12 리소트래커 그린 또는 다른 BODIPY 컨쥬게이트를 추가하고 100 나노몰러의 최종 농도를 추가합니다.
사용되는 BODIPY의 방출 색상을 기반으로 배출 경로에 적절한 필터 세트를 장착합니다. 현미경을 켭니다. 현미경 단계, 488 나노미터 및 561 나노미터 레이저뿐만 아니라 카메라.
현미경 목표에 신흥 오일 한 방울을 추가합니다. 밝은 필드 이미징, 레이저 파워, 레이저 셔터 및 이미징을 위한 카메라 설정을 위해 LED 조명을 제어하는 HAL4000 소프트웨어를 엽니다. EMCCD 게인을 30도로 설정하고 카메라 온도를 섭씨 영하 68도로 설정합니다.
카메라와 해당 소프트웨어를 준비하여 20 Hertz에서 영화를 녹화합니다. 현미경 스테이지 히터를 켜고 섭씨 37도의 온도와 이산화탄소 5%로 설정합니다. 그에 따라 객관적인 보정 색상을 조정합니다.
현미경 단계에 샘플을 장착하고 초점 시스템이 참여할 때까지 초점을 맞춥니다. 건강한 세포가 시야에 나타날 때까지 스테이지 컨트롤러를 사용하여 스테이지를 이동합니다. 1개의 분자 국소화 현미경 검사법에 대해 561 나노미터 레이저의 레이저 전력이 평방 센티미터당 821킬로미터 사이로, 단일 분자 형광 모공이 적색 이동 방출 채널에서 검출되는 등, 무너마뿐만 아니라 디머의 여기를 위한 로드 레이저 셔터 서열.
488나노미터 레이저의 경우 035점과 포인트 07와트 사이의 레이저 전력을 조정하여 기존의 형광이 녹색 방출 채널에 나타나게 합니다. 영화에 대한 대상 폴더를 선택하고 5000에서 20000 획득 프레임을 기록하여 슈퍼 해상도 이미지를 재구성하기에 충분한 현지화를 수집합니다. 다른 보기 필드로 이동하고 더 많은 셀에 대한 데이터를 수집하기 위해 반복합니다.
영화를 단일 분자 국소화 현미경 분석 소프트웨어로 로드합니다. 시각적으로 영화를 상영하고 단 하나 분자 형광 깜박임이 보이는 등 대비 설정을 조정합니다. 2D 가우시안, PSFs를 피팅하기 위한 단일 분자 식별 매개변수를 설정합니다.
일부 예제 프레임을 통해 시각적으로 검사하여 식별 매개 변수를 확인하고 뚜렷한 단일 분자 형광 버스트를 안정적으로 감지합니다. 단일 분자 국소화 현미경 검사를 수행하기 위한 프레스 분석은 최적화된 식별 파라미터를 사용하여 분석을 상상한다. 그리고 각 단일 분자를 감지된 광자 수의 역 제곱 근당에 의해 폭이 가중치가 있는 2D Gaussian으로 렌더링합니다.
데이터의 품질을 평가합니다. 제한된 프레임 범위를 사용하여 보다 구체적인 인스턴스 및 시간에 단일 분자 분포를 관찰합니다. 이는 데이터 수집 중 세포기관 이동을 고려합니다.
이 연구에서는 BODIPY 컨쥬게이트를 사용하여 단일 분자 국소화 현미경 검사법을 사용하여 최적화된 샘플 준비, 데이터 수집 및 분석 절차를 제시했습니다. 단일 분자 국소화 현미경 데이터를 획득하고 분석하기 위한 워크플로우의 예를 입증하기 위해 효모의 BODIPY는 광학 회절 제한 이하의 지질 방울을 해결하기 위해 사용되었습니다. GFP 및 mEos2와 같은 다른 프로브와 결합된 BODIPY의 상이한 다색 이미징 모드의 예가 여기에 나와 있다.
BODIPY-C12는 금식 시 세포 주변의 이동식 비지질 물방울 클러스터에서 형성된 반면, 공급 조건하에서 지질 방울로 통합하는 것과는 대조적입니다. BODIPY 컨쥬게이트의 단일 분자 국소화 현미경 능력을 포유류 세포로 더욱 확장하기 위해, 살아있는 U2OS 세포에서 BODIPY-C12 및 리소트래커 그린을 심발하였다. BODIPY 농도를 최적화하고 레이저 파워는 밝은 단일 분자 신호를 시각화하고 슈퍼 해상도 이미지를 재구성하기 위한 중요한 단계입니다.
이 방법은 살아있는 세포 내부의 특정 바이오 분자의 특별한 시간 분포에서 고해상도 통찰력을 얻기 위해 다른 BODIPY 컨쥬게이트와 함께 사용할 수 있습니다. 우리의 테크닉은 나노 스코픽 렌즈 규모에 지질 방울과 지방산 생물학을 더 심문하는 길을 포장했다. 그러나, 이 응용 프로그램은 다양한 기능 BODIPY 컨쥬게이트의 가용성으로 인해 특정 필모테를 훨씬 넘어.
생물학적 샘플 및 염료를 처리하기위한 표준 수술 절차를 따르고, 또한 우리의 의무 헤지가되고 레이저 안전 절차를 따르십시오.
