단백질 합성의 비율은 질병과 노화 도중 방해됩니다. 광표백 후 형광 회복, 또는 FRAP는 생체 내에서 단백질 합성 속도를 측정할 수 있게 한다. 우리는 GFP를 표현하는 투명한 C.elegans 벌레를 광표백 후 새로운 단백질 합성을 모니터링하는 모델로 사용합니다.
당사는 다른 프로모터의 밑에 GFP를 표현하는 형질 전환 벌레를 사용하여 형광 복구를 측정하기 위하여 실제적인 지침을 제공합니다, 또는 특정 세포 또는 조직에서. 또한, 이 방법은 실시간으로 단백질 합성 속도 모니터링을 제공합니다. 해부 스테레오 현미경을 사용하여 야생 형 및 돌연변이 형 선충의 발달 단계와 성장을 평가합니다.
원하는 형광 기자를 운반하는 야생형 및 돌연변이 형균 동물의 10L4 애벌레를 골라낸 선충 성장 미디어 플레이트에 E.coli로 시드를 선택합니다. 섭씨 20도의 표준 온도에서 선충을 배양하고 성장시면 됩니다. 4 일 후, 플레이트는 형질 전환 벌레의 혼합 된 인구를 포함.
갓 시드된 OP50 NGM 플레이트에 각 변형의 15 L4 애벌레를 선택하고 전송합니다. FRAP 분석작업을 수행하고 성인이 된 첫날에 단백질 합성 속도를 모니터링합니다. 다음 날, 사이클로헤시미드 함유 NGM 플레이트를 양수 제어로 준비하고 사용합니다.
UV 빛으로 15 분 동안 시드 NGM 플레이트를 노출하여 박테리아를 죽입니다. 식기 부피의 mL 최종 농도당 너무 500 마이크로그램의 세균 시드 플레이트 위에 사이클로헨시미드를 추가합니다. 접시가 건조하도록 허용합니다.
차량 및 사이클로헤시미드 함유 플레이트에 GFP를 발현하는 트랜스제닉 선충을 이송합니다. 섭씨 20도의 표준 온도에서 2 시간 동안 동물을 배양하십시오. 1일 성인 형질전환 동물을 중앙에 20마이크로리터 OP50 드롭으로 시드된 개별 NGM 플레이트로 선택하고 옮직합니다.
뚜껑을 제거하고 각 플레이트를 상피 현미경의 20H 객관적렌즈 아래에 놓습니다. 포토표백 전에 참조 이미지를 집중하고 캡처합니다. 10 분 동안 각 샘플을 표백합니다.
포토표백 후 이미지를 캡처합니다. 동물을 개별 NGM 플레이트에 보관하고 복구할 수 있습니다. 상화계 에서 적어도 6시간 동안 각 형광 기자의 회복을 기록하고 기록한다.
아가로즈 패드 2%를 준비하고 아가로즈 패드 의 중앙에 M9 버퍼 10 개의 마이크로 리터 드롭을 추가합니다. 팬 뉴런 세포질 GFP를 발현하는 5개의 형질선선색을 M9 버퍼의 한 방울로 옮긴다. 속눈썹을 사용하여 액체를 퍼뜨리시면 됩니다.
동물은 Agar에 M9 흡광도 때문에 2 분 이내에 감소 된 움직임을 표시합니다. 속눈썹 선택을 사용하여 선충의 위치를 변경합니다. 커버 슬립을 사용하지 않고 상피 현미경의 40H 객관적렌즈에 샘플을 놓습니다.
참조 이미지를 집중하고 캡처합니다. 90초 동안 대상 관심 영역을 photo표백합니다. 포토표백 후 이미지를 캡처합니다.
광표백 선충에 M9 버퍼 10방울을 추가합니다. 동물이 5 분 동안 회복하도록하십시오. 속눈썹 선택 또는 파이펫을 사용하여 선충을 중앙에 20 마이크로리터 OP50 드롭으로 시드된 개별 NGM 플레이트로 전송합니다.
상피성 스테레오현미경으로 매 시간마다 각 샘플의 이미지를 캡처합니다. fe-2 프로모터를 사용하여 체세포 조직 전반에 걸쳐 세포질 GFP를 표현하는 야생형 및 fe-2 돌연변이 벌레는 포토블리싱 직후, 그리고 5시간 후 복구전에 비교되었다. fe-2 돌연변이가 소형 복구 용량을 가지고 있는 동안 야생 형 동물은 완전히 회복되었습니다.
따라서 야생형 벌레는 광표백 후 정상적인 단백질 합성을 시작하고, mRNA 번역 개시인 fe-2가 결여된 벌레는 그렇게 할 수 없으며, 형광 회복의 속도가 생체 내 단백질 합성의 속도를 나타낸다는 것을 나타낸다. 사이클로헤시미드, mRNA 번역의 특정 억제제는 단백질 번역 억제를 위한 긍정적인 대조군으로서 사용될 수 있다. 실제로, 발기인의 밑에 세포질 GFP를 표현하는 사이클로헤시미드 처리된 형질 동물은 광표백시 그들의 형광을 복구하지 않습니다.
mRNA 가공 체는 단백질 번역의 비율에 영향을 미칩니다. GFP 팬-뉴런을 발현하는 야생형 및 edc-3 돌연변이 선충은 헤드 부위의 표적 광표백시 회복 능력에 대해 검사되었다. 형광 회복은 야생 형 벌레에 비해 edc-3-결핍 동물에서 훨씬 느립니다.
단백질 합성 변조는 유기체 항상성에 필수적입니다. 노화 하는 동안, 글로벌 뿐만 아니라 특정 단백질 합성 혼란. 단백질 번역 균형은 노화와 노화를 직접 제어합니다.
특히, 번역 기계의 핵심 구성 요소뿐만 아니라 P-바디 상호 작용 구성 요소는 노화 과정을 가속화한다. 번역 개시의 왜곡은 노화를 감속시다. 따라서, FRAP에 의한 글로벌 단백질 합성 율을 측정하는 것은 노화 과정의 직접적인 판독이다.
