이 프로토콜은 96웰 DNA 추출 플레이트 로딩의 효율성을 높이는 동시에 시료 교차 오염의 위험을 줄이는 기술을 제공합니다. 이 기술은 96웰 플레이트의 각 우물에 개별적인 샘플을 추가하여 DNA 추출의 중요한 첫 번째 단계 동안 오염 가능성을 감소시킵니다. 이 방법론은 미생물군유전체 연구의 다양한 분야에 적용될 수 있습니다.
실험을 시작하기 전에 벤치 탑을 70%에탄올로 미스트합니다. 닦은 후 벤치를 10 % 표백제로 분사하기 전에 벤치를 공기 건조하게하십시오. 닦아 공기 건조 후, 현미경, 경직, 곡선 수술 가위를 95 %에탄올에 찍어 화염에 도구를 노출.
그런 다음 각 도구를 10 % 표백제에 담그고 공구가 공기 건조할 수 있도록합니다. 서브 샘플링 전에 에탄올은 장갑을 살균하고 토양 샘플을 철저히 균질화합니다. 다음으로 각 튜브에 위치가 잘 되는 샘플 ID를 할당합니다.
각 튜브가 약 반 가득 차날 때까지 튜브 당 하나의 샘플로 95 개의 밀리리터 원심 분리튜브를 채웁니다. 96번째 튜브는 추출 공백으로 사용되어야 합니다. 얼음에 하위 샘플 튜브를 놓고 96 웰 플레이트의 우물 라벨에 따라 96 개의 멸균 200 마이크로 리터 플랫 캡 PCR 튜브를 표시 한 다음 라벨 200 마이크로 리터 튜브를 96 웰 랙에 순서대로 배치합니다.
실험을 위해 96웰 플레이트를 준비하려면 플레이트에서 덮개를 제거하고 덮개를 멸균 비닐 봉지에 넣습니다. 오염을 방지하기 위해 가방을 밀봉하고 피어싱 가능한 밀봉 필름의 사전 절단 조각으로 접시를 덮습니다. 그런 다음 고무 롤러를 사용하여 씰을 접시에 단단히 부착하고 접시를 섭씨 4도에 보관하십시오.
서브 샘플을 플레이트로 옮기려면 2밀리리터 서브 샘플 튜브 중 24개를 얼음 블록에 넣고 샘플 이름과 위치 시트를 사용하여 적절한 200 마이크로리터 플랫 캡 튜브를 선택합니다. 소량 샘플을 한 번에 하나씩 소용돌이치며, 샘플당 5초 동안 균질화를 보장하고 각 샘플의 약 200마이크로리터를 적절한 PCR 튜브에 적재합니다. 24개의 샘플이 모두 로드되면 표백된 담근 종이 닦기를 사용하여 하나의 PCR 튜브 의 외부를 청소하고, 반전하고 벤치의 튜브를 탭하여 샘플을 튜브 의 상단으로 이동시합니다.
화염 살균 및 표백 가위를 사용하여 PCR 튜브의 바닥을 클립하여 시료에 대한 개구부를 만들고 적절한 우물에 도달 할 때까지 절단 끝이 위로 향하도록 플레이트 위에 튜브를 전달합니다. 플레이트를 약간 기울여 미리 절단가능한 피어싱 가능한 밀봉 필름의 구멍을 용이하게 하고, 튜브를 올바른 우물 바로 위에 넣고, 빠르지만 조심스럽게 플레이트를 반전하여 절단 팁이 잘 들어갑니다. 모든 토양이 튜브에서 우물로 떨어질 때까지 살균 도구를 사용하여 튜브의 상단을 누릅니다.
그리고 납이 닫힌 상태로 튜브를 우물에 둡니다. 모든 샘플이 동일한 방식으로 로드된 경우 200마이크로리터 플랫 캡 PCR 튜브 를 제거하고 750 마이크로리터의 비드 용액을 샘플에 잘 추가합니다. 200 마이크로 리터 플랫 캡 PCR 튜브를 우물로 밀어 넣는 우물에 다시 놓습니다.
그리고 샤피를 사용하여 튜브의 상단을 표시하여 우물이 로드되었음을 나타냅니다. 모든 우물에 구슬로 적재되면 24개의 샘플 튜브를 섭씨 20도까지 반환하고 24개의 새로운 서브 샘플 튜브를 얼음 블록에 추가하여 다음 샘플 세트를 96웰 플레이트에 적재할 수 있도록 합니다. 모든 95개의 우물에 샘플 및 비드 솔루션이 로드되면 96번째 우물에만 비드 용액을 추가합니다.
모든 튜브를 제거하고 덮여 우물 위에만 전달하고 조심스럽게 접시에서 관통 필름을 제거합니다. 그런 다음 조심스럽게 접시 덮개를 비닐 봉지에서 접시로 옮기고 계획된 추출이 될 때까지 접시를 섭씨 20도로 놓습니다. 플레이트 로딩 방법의 비교는 입증된 방법이 빈 우물 내에서 가장 낮은 DNA 농도를 초래한다는 것을 보여줍니다.
이 방법을 사용하여, MCPherson 등에서 제안된 방법을 사용할 때 DNA 농도가 현저히 낮았다. 이 방법에 의한 DNA 농도는 카겐 기본 방법과 통계적으로 다르지 않았다. 세 가지 방법 모두 마이크로 리터 당 2 나노 그램 의 DNA 농도를 평균합니다.
이 새로운 방법만이 측정 가능한 DNA 농도없이 우물을 생산하지만. 유출 가능성을 최소화하기 위해 플레이트 위로 이동할 때 200 마이크로리터 튜브를 똑바로 세워 놓고 판을 기울여 튜브를 올바른 우물로 삽입하십시오.
