본 SEM 이미징 프로토콜은 시험관 내에서 세포 표면 상의 막 프릴 형성, 원형 돌출부 및 마크로피노시스 컵을 시각화하고 정량화하는 도구를 제공한다. SEM은 거대 피노사이시스 막 활성을 시각화하는데 사용될 수 있는 세포 표면의 고해상도 이미지를 제공한다. 이 기술은 거대 세포증을 조절하는 새로운 신호 전달 경로를 발견하고 미세 세포증의 새로운 자극제 및 억제제를 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
먼저 오토클레이브 포셉을 사용하여 멸균 유리 커버 슬립을 24웰 플레이트의 웰에 배치합니다. 그 다음 시드 미가공 264.7 대식세포를 커버 상에 밀리리터 당 6번째 세포로 10의 밀도로 미끄러뜨리고 플레이트를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소의 가습 인큐베이터에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다. 다음 날, 각 웰의 배지를 500 마이크로리터의 신선한 완전 배지로 교체한 다음, DMSO 또는 EIPA와 같은 거대 세포증 억제제와 같은 비히클 대조군으로 30분 동안 대식세포를 전처리한다.
다음에, 막 프릴링을 촉진하기 위해, 세포를 대식세포 콜로니 자극 인자의 밀리리터 당 1마이크로몰 PMA 용액 또는 100 나노그램과 같은 거대세포증 자극제로 30분 동안 처리한다. 주사 전자 현미경을 위해 세포를 고정시키기 위해, 웰로부터 배지를 흡인하고 커버 슬립을 빙냉 PBS로 두 번 세척한 다음, 커버 슬립을 실온에서 30분 동안 고정제에서 인큐베이션한 다음, 섭씨 네 도에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 세포 단일층을 교란시키지 않고, 부드럽게 세척한 다음, 커버슬립을 500 마이크로리터의 0.1-모터 소듐 카코딜레이트에서 15분 동안 인큐베이션한다.
500 마이크로리터의 증류수로 두 번 세척한 후, 커버 슬립을 각 세척에서 10분 인큐베이션으로 등급화된 에탄올 시리즈의 500 마이크로리터에서 두 번 세척한다. 임계점 건조를 수행하려면 커버 슬립을 임계점 건조기에 넣고 100% 에탄올로 덮으십시오. 그런 다음 전원 버튼을 누르고 이산화탄소 탱크를 엽니 다.
온도가 영하로 떨어질 때까지 냉각 버튼을 약 30초 동안 누릅니다. 그런 다음 챔버 창에 거품이 나타날 때까지 채우기 단추를 누릅니다. 다음으로, 퍼지 배기가스에서 에탄올 냄새가 사라질 때까지 퍼지 버튼을 누릅니다.
그런 다음 온도가 영하로 떨어질 때까지 냉각 버튼을 다시 누릅니다. 전체 및 지우기 단추를 다시 눌러 단추를 끕니다. 그런 다음 이산화탄소 탱크를 닫으십시오.
차가운 바닥을 다시 눌러 끈 다음 열 버튼을 누릅니다. 온도를 섭씨 42도로, 압력을 평방 인치당 1, 200파운드로 설정합니다. 압력과 온도가 안정되면 블리드 버튼을 눌러 압력이 천천히 감소하도록하십시오.
챔버 압력이 평방 인치당 150 파운드에 도달하면 통풍구 바닥을 누르고 압력이 평방 인치당 0 파운드로 떨어질 때까지 기다리십시오. 임계점 건조기를 끄고 덮개 슬립을 제거합니다. 다음으로, 탄소 접착 탭을 사용하여, 주사 전자 현미경을 위해 알루미늄 시편 마운트에 커버 슬립을 장착한 다음, 스퍼터 코터에서 금 또는 팔라듐을 사용하여 스퍼터 코팅을 진행한다.
스퍼터 코터의 전원 버튼을 켭니다. 진공이 30 밀리토르에 도달하면 가스 스위치를 끄고 미세 가스 밸브를 시계 반대 방향으로 돌려 챔버를 플러시하여 습도와 공기를 제거하십시오. 진공이 200밀리토르로 증가하면 가스 스위치를 끄고 진공이 30밀리토르에 도달할 때까지 기다립니다.
그런 다음 챔버를 다시 플러시하여 시연된 대로 습도와 공기를 제거합니다. 챔버를 세 번 플러싱 한 후 타이머 하단을 밀고 게이지가 10 밀리 암페어를 읽을 때까지 전압 노브를 조정하십시오. 그런 다음, 코팅된 커버 슬립을 챔버로부터 제거한다.
멤브레인 프릴을 시각화하고 정량화하려면 샘플 커버 슬립을 주사 전자 현미경의 챔버에 넣고 문을 닫은 다음 evac 버튼을 누릅니다. 현미경 작동 소프트웨어를 열고 가속 전압을 15킬로볼트로, 작동 거리를 10밀리미터로 설정합니다. 좌표 단추를 누르고 셀이 관찰 화면 중앙에 나타날 때까지 컨트롤러 주위로 이동합니다.
배율을 3, 500 X로 설정하고 사진 버튼을 클릭하여 샘플을 이미지화합니다. 여기에 나타낸 것은 PMA 및 대식세포 콜로니 자극 인자로 처리한 후 원시 264.7 대식세포에서 막 프릴 형성을 보여주는 대표적인 주사 전자 현미경 이미지이다. 대식세포를 대식세포증 억제제 EIPA로 전처리하면 막프릴 형성이 약화된다.
프릴 형성 동안, 원형질막은 시트형 막 돌출부, C자형 막 프릴 및 마크로피노시스 컵을 포함하여 뚜렷한 형태학적 단계를 거친다. PMA 및 대식세포 콜로니 자극 인자 처리에 따른 막 프릴 형성은 주사 전자 현미경을 사용하여 정량화할 수 있는 반면, 마크로피노좀 형성은 텍사스 레드 덱스트란 및 FM4-64를 이용한 공초점 현미경과 같은 대체 이미징 기술에 의해 확인될 수 있다. 파란색 화살표는 막 주름을 나타내고 노란색과 녹색 화살표는 미세 피노좀을 가리 킵니다.
마지막으로, 거대세포증은 FITC 또는 텍사스 레드 덱스트란과 같은 형광 유체 상 마커를 사용하는 유세포 분석기를 통해 확인 및 정량화될 수 있다. SEM 이외에, 형광 표지된 덱스트란 내재화의 살아있는 세포 이미징 및 유세포 분석 또한 거대 세포증을 조사하고 정량화하기 위해 수행될 수 있다.
