이 프로토콜은 산화환원 메커니즘에 대한 간섭을 피하기 위해 낮은 수준의 BH4 및 질산염을 가진 신중하게 정의 된 배지 및 혈청을 사용하여 iNOS 또는 BH4 결핍 마우스로부터 골수 유래 대식세포를 배양하는 데 도움이됩니다. 배양 과정에서 잠재적 인 오염 물질의 수준을 신중하게 제어함으로써 산화 질소 간섭을 제한하여 모델 시스템의 정확성과 재현성을 보장 할 수 있습니다. 이 방법은 바이오 프테린, 산화 질소 및 이러한 필수 화합물과 관련된 모든 하류 요인을 정확하게 측정 할 수있게합니다.
이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 박사 후 연구원 인 토마스 니콜 (Thomas Nichol) 박사가 될 것입니다. 시작하려면 다리를 70 % 에탄올에 두 분 동안 두어 모피 또는 잔류 물을 씻어 내십시오. 그런 다음 다리를 깨끗하고 멸균 된 세균 학적 페트리 접시로 옮깁니다.
칼날로 뼈의 길이를 따라 조심스럽게 긁어 내고 힘줄을 자르고 뼈에서 근육을 제거하십시오. 뼈가 근육에서 제거되면 무릎 바로 아래에있는 경골 꼭대기의 epiphysis를 잘라냅니다. 경골은 비골과의 교차로 바로 위에있는 하단 끝에서 절단 될 수 있습니다.
마지막으로, 무릎과 엉덩이 관절에 가까운 대퇴골의 양쪽 끝에있는 epiphysis를 잘라냅니다. 골수를 플러시하려면 10 밀리리터 주사기에 10 밀리리터의 PBS를 채우고 바늘에 부착하십시오. 그런 다음 바늘을 뼈의 골수강에 삽입하십시오.
PBS의 하나 ~ 두 밀리리터로 부드럽게 플러시하여 바늘을 위아래로 움직입니다. 그런 다음 현탁액을 한 밀리리터 주사기 안팎으로 다섯 번에서 열 번 당겨 분해하십시오. 현탁액을 하나의 밀리리터 주사기에 모으고 70 마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 깨끗한 50 밀리리터 원심분리 튜브에 통과시킨다.
마지막으로 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 나중에 사용하기 위해 골수를 동결시키기 위해, 세포를 실온에서 다섯 분 동안 1000 G에서 원심분리한다. 상청액을 버리고 적색 펠렛을 두 밀리리터의 부동액에 재현탁하십시오.
그런 다음 밤새 섭씨 80도에서 배양하십시오. 얼어 붙은 경우 서스펜션을 섭씨 37도에서 빠르게 해동하십시오. 세포 현탁액을 DMEM/F-12 배지 세 밀리리터가 들어있는 깨끗한 멸균 튜브로 옮깁니다.
다음에, 원심분리에 의해 세포를 펠릿화한다. 상청액을 버리고 펠렛을 준비된 DMEM/F-12 배지 세 밀리리터에 재현탁합니다. 세포를 계수하고 준비된 DMEM / F-12 배지의 비 TC 코팅 플라스틱 도자기에 플레이트하십시오.
다음으로, 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 인큐베이션한다. 다섯 번째 날에는 DMEM/F-12 배지의 원래 부피의 50%를 추가하여 세포에 먹이를 줍니다. 여섯째 날에, 준비된 GM-CSF를 마이크로리터 당 50 나노그램의 최종 농도로 첨가하여 세포를 자극하여 세포 배양 배지에 직접 첨가한다.
일곱째 날에, 세포에서 모든 배지를 제거한다. 그런 다음 미리 가온된 PBS로 세포를 간단히 세척하고 2% 낮은 내독소 FBS, 1X 페니실린 또는 스트렙토마이신, L-글루타민, 마이크로리터 M-CSF 당 25나노그램, 마이크로리터 GM-CSF 당 50나노그램을 함유하는 DMEM/F-12 배지를 첨가한다. 마지막으로, 세포를 배지에서 밤새 인큐베이션하여 대식세포를 M0 표현형으로 활성화시킨다.
M1 표현형의 경우, 마이크로리터 LPS 당 100 나노그램, 마이크로리터 IFN-감마 당 10 나노그램으로 세포를 자극하십시오. M2 표현형의 경우, 마이크로리터 IL-4 당 100 나노그램으로 세포를 자극한다. 세포를 밤새 인큐베이션한다.
여덟 번째 날에, 세포는 연구자의 필요에 따라 수확 또는 하류 처리를 위해 준비됩니다. 10 % FBS로 보충 된 배지는 M-CSF 및 GM-CSF 또는 LCM에 관계없이 유사한 아질산염과 테트라 하이드로 바이오 프테린을 가지고있었습니다. 그러나 총 바이오프테린 수준은 LCM 보충 배지에서 더 높았다.
그러나, 상이한 LCM 배치들 사이의 더 많은 가변성이 관찰되었다. PCR은 야생형 마우스에서 1030개의 염기쌍 생성물을 나타냈고, GCH 넉아웃 마우스는 1392개의 염기쌍 생성물을 생산하여 임계 엑손의 절제를 확인했다. 타목시펜 처리는 녹아웃 세포에서 GCH 단백질을 폐지하였다.
녹아웃 및 대조군 세포는 LPS 및 IFN 자극에 따라 여전히 iNOS를 생성하였다. 조건부 GCH 넉아웃 마우스로부터 배양된 BMDM은 테트라하이드로바이오프테린이 유의하게 감소하고 아질산염이 감소함을 나타내었다. LCM 배지에서 배양된 동일한 세포는 GCH1 발현이 없었다.
그러나, 세포는 녹아웃 후 상당한 양의 테트라하이드로바이오프테린과 아질산염을 생산한다. 여덟째 날에, 타목시펜의 상이한 농도에서 불활성화 대조군과 GCH 녹아웃 BMDM 사이의 형태학에 유의한 차이가 없었다. BMDM은 둥근 부착성 세포와 길쭉한 사지가있는 자극되지 않은 대식세포에서 예상되는 특징을 보여줍니다.
이와 같은 일차 세포로 작업 할 때는 모든 조직과 장비를 철저히 살균해야합니다. 또한, 올바른 배지와 보충제를 선택하는 것은 낮은 산화 질소와 BH4 환경을 유지하는 데 중요합니다. 세포 펠릿 및 배지는 산화질소, 바이오프테린 또는 세포 산화환원 상태의 역할에 초점을 맞춘 다양한 하류 적용에 사용될 수 있다.
HPLC, qPCR, 및 웨스턴 블롯을 포함할 수 있으며, 그 중에서도 다른 것들이다.
