bipartite GAL4-UAS 시스템은 현면 조절 방식으로 유전자 발현의 유전자 변형을 통해 Anopheles 감비아에 있는 기능적인 유전 분석을 위한 다목적 공구입니다. 이진 시스템은 심각한 피트니스 비용이 유도되더라도 유전자 발현의 표현성 특성화를 위한 실험적 접근법의 유연성을 가능하게 합니다. 이 시스템은 살충제 저항, 병원체 전송, 또는 유전 통제 방법에 사용된 유전자의 현상 특성화를 위해 사용될 수 있습니다.
연구 기술자 인 Fraser Coleman은 스테레오 현미경으로 사용하기에 적합한 명확한 평평한 접시에 잘라 3 밀리리터 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하여 pupae를 수집하여이 절차를 시연하는 데 도움이됩니다. 조심스럽게 강아지 주변의 물의 대부분을 제거합니다. 형광 전구를 켜고 따뜻하게 합니다.
형광 마커를 선별할 때 예상되는 다른 표현형의 발현 및 비율의 색상 현면 패턴을 고려하십시오. 형광 스테레오스코프에서 필요한 필터를 선택하고 스테이지 플레이트의 중앙을 향하는 빛의 색광선이 있는지 확인합니다. 백색광 아래에서, 볼 의 필드에 강아지를 중심으로 초점을 가져.
백색광을 끄고 미세 한 초점을 사용하여 눈에 보이는 형광 패턴으로 관심표현형을 운반하는 강아지의 영역을 가져옵니다. 미세한 디테일의 페인트브러시를 사용하여 강아지를 부드럽게 돌리고 항문 패들을 움직여 외부 생식기를 식별할 수 있습니다. 특유의 외부 생식기를 기반으로 한 별도의 푸파.
남성은 항문 패들의 길이의 약 절반에 달하는 최종 등쪽 세그먼트에서 압출되는 긴 튜브를 가지고 있습니다. 여성 강아지의 외부 생식기는 상당히 짧고 양면. 성별된 푸파를 10밀리리터 튜브에 물로 분리하고 코튼 울 공으로 튜브를 밀봉합니다.
튜브에서 원하는 수의 남성과 여성 성인을 케이지 또는 작은 양동이로 흡입하여이 전송 중에 성인을 손상시키지 않도록주의하십시오. 혈액 공급 하기 전에 5 ~ 7 일 동안 십자가를 유지 합니다. 다음 날, 계란은 배아 발달을 연구하기 위하여 집합될 수 있습니다.
oviposition 챔버를 조립하 고 신중 하 게 소개 10 받는 것 15 혈액 공급 여성 그것에. oviposition 챔버를 덮고 20 분 동안 둡니다. 50밀리리터 폴리프로필렌 튜브를 oviposition 냄비에서 조심스럽게 분리하여 모기를 방출하지 않도록 합니다.
냄비를 덮고 계란이 관심의 발달 단계로 성숙 할 수 있습니다. 미세한 디테일의 페인트브러시를 사용하여 냄비에서 계란을 집어 40 평방 밀리미터 굴착 유리 블록에 물에 놓습니다. 마이크로파이프로 유리 블록에서 물을 조심스럽게 제거하고 500 마이크로리터의 FAA로 달걀을 덮습니다.
실온에서 궤도 셰이커를 30분 동안 부드럽게 진동시합니다. 완전히 FAA 용액의 모든 흔적을 제거하기 위해 증류수로 계란을 15 번 헹구십시오. 1000 마이크로 피펫을 사용하여 한 번에 증류수 1 밀리리터를 제거하여 계란을 손상시키지 않도록 주의하십시오.
Trpis 용액 1밀리리터로 고정 된 계란을 덮고 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 계란은 일단 삭제된 유백색에 도달하는 잠복의 5 분 후에 창백한 패치를 개발하기 시작합니다. Trpis 용액의 모든 흔적을 제거하기 위해 증류수로 계란을 15 번 완전히 헹구십시오.
3xP3 프로모터에 의해 구동되는 형광 마커의 발현은 아노펠스 감비아에 푸파의 눈과 복부 중추에서 관찰된다. 다른 색깔의 형광 마커를 사용하여 다른 GAL4 및 UAS 구성 요소를 운반하는 수정 된 개인의 선택 및 검사를 허용합니다. bipartite GAL4-UAS 시스템으로 작업할 때, GAL4 및 UAS 구성 요소를 모두 운반하는 자손을 얻기 위해 다른 긴장에서 남성과 여성을 교차할 필요가있다.
강아지의 남성과 여성 외부 생식기에서 관찰 된 차동 형태는 섹스에 사용됩니다. 식별할 수 없는 pupae의 예가 여기에 강조 표시됩니다. 오른쪽에 표시된 것처럼 강아지에서 모든 물을 제거하면 항문 패들이 생식기의 시각화를 모호하게할 때 섹스링 어려움을 증가시킵니다.
이 양파르트 GAL4-UAS 시스템은 제어된 현시성 방식으로 유전자 발현의 변형을 허용합니다. 이는 응답자 라인 UAS-mCherry와 함께 운전자 라인을 표현하는 noenocyte 및 유비쿼터스 GAL4 4를 교차하여 시각화할 수 있습니다. 이중 PARTite GAL4-UAS 시스템을 사용하는 주요 이점은 배아 단계에서도 치명적인 표현형을 연구할 수 있다는 것입니다.
이렇게하려면 배아의 내부 형태를 시각화해야합니다. 12, 24 및 36시간 후 포설 후 배아 발달의 다른 단계에서 관찰된 정상적인 형태학적 특성은 배아 청산 프로토콜의 완성 후 볼 수 있다. 이 절차 전반에 걸쳐 푸파와 계란은 담정할 수 없다는 것이 중요합니다.
따라서 액체를 제거할 때 신속하게 작업하는 것이 중요합니다. GAL4-UAS 방법은 우리가 기능적으로 살충제 저항에 관련되고 유전자 드라이브 통제 방법에 있는 잠재적인 사용을 가진 그(것)들을 특성화하는 것을 허용했습니다.
