이 프로토콜은 광유전학 기술의 새로운 발전과 약물 남용의 전임상 모델을 사용하여 재발을 촉진하는 신경 회로의 가소성을 역전시키기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 깨어있는 동물에서 시냅스 활동의 회로 특이 적 조작을 허용한다는 것인데, 이는 미래의 단서 동기 부여 코카인 추구 행동에 오래 지속되는 억제 효과가 있습니다. 이 방법은 행동적으로 관련된 신경 가소성을 구체적으로 조작하기 위해 다른 많은 시스템과 회로에서 활용 될 수 있습니다.
26게이지 스테인리스 스틸 주입 캐뉼러를 1마이크로리터의 농축 AAV 용액으로 채워진 해밀턴 주사기에 연결하여 수술 준비를 시작합니다. 동물을 마취 한 후 수술 부위를 면도하고 텍스트 원고에 설명 된대로 건조를 방지하기 위해 눈을 윤활하십시오. 다음으로, 진통제 인 카프로 펜의 체중을 등 상부의 피부를 통해 피하 주사하고, 허리의 피부를 통해 5 밀리리터의 젖산 링거 용액을 피하 주사한다.
그런 다음 정맥 카테터 이식을 수행하십시오. 카테터 이식 직후, 쥐를 입체 프레임에 고정시켜 아데노 관련 바이러스 주사를 수행한다. 국소 적으로 마취하기 위해 두개골 위의 피부를 통해 리도카인 덩어리를 피하 주사 한 다음 두개골의 앞쪽에서 뒤쪽으로 0.5mm 절개를합니다.
두개골 표면을 노출시키기 위해 위에 놓인 조직을 제거하십시오. 쥐의 머리를 앞쪽 후축을 따라 수평을 맞추고 브레그마에 대한 입체 좌표를 0으로 만든 다음 작은 드릴 비트가 장착 된 dremel 도구를 사용하여 두개골을 통해 3 개의 작은 구멍을 뚫고 드라이버로 스테인레스 스틸 나사를 제자리에 장착하십시오. AAV 주입의 경우 내측 생식기 핵 또는 MGN의 경우 "쥐 뇌 아틀라스"의 좌표를 기반으로 양측 구멍을 뚫습니다.
bregma에 대해 사용되는 좌표는 전방 후축에서 마이너스 5.4mm, 내측 측면 축에서 3mm, 등쪽 복부 축에서 마이너스 6.6mm입니다. 캐뉼러가 MGN에 적절하게 위치 할 때까지 분당 약 4 밀리미터로 주입 캐뉼러를 천천히 내리고 분당 0.1 마이크로 리터의 속도로 농축 된 AAV 용액을 주입합니다. 주입이 완료된 후 주사 캐뉼러를 5분 동안 그대로 두어 바이러스가 캐뉼라에서 멀리 퍼질 수 있도록 한 다음 뇌에서 캐뉼라를 천천히 빼냅니다.
다음으로, 내측 생식기 핵 측면 편도체 말단을 표적으로 하는 시섬유의 이식을 진행한다. dremel 도구를 사용하여 원고에 설명 된대로 좌표에서 측면 편도체 위의 양측 구멍을 뚫습니다. 집게를 사용하여 광섬유 임플란트의 페룰을 잡고 페룰을 정위 어댑터에 고정합니다.
섬유 끝이 LA의 등쪽 부분에 앉을 때까지 분당 2mm의 속도로 섬유를 천천히 내립니다. 페룰을 피부에 고정하고, 먼저 Loctite 순간 접착제의 얇은 층을 사용한 다음 치과 용 시멘트를 사용합니다. 치과 용 시멘트가 충분히 건조되면 페룰 슬리브와 먼지 커버로 페룰을 덮으십시오. 수술 절차 후, 쥐를 개별적으로 수용하고 겐타 마이신 밀리리터 당 5 밀리그램과 헤파린 밀리리터 당 30 USP 단위를 함유 한 식염수로 매일 카테터를 플러시합니다.
행동 실험 시작 24 시간 전에 음식은 쥐를 자유 먹이 체중의 90 %로 제한합니다. 쥐를 조작 챔버에 넣고 코카인 밀리리터 당 2 밀리그램의자가 투여를위한 매일 1 시간의 훈련 세션을 고정 된 비율의 강화 일정에 따라 받는다. 챔버에서 쥐가 레버 프레스를 허용하십시오.
지정된 활성 레버를 누르면 킬로그램 당 1 밀리그램의 코카인 주입과 복합 조명 및 톤 큐가 10 초 동안 표시됩니다. 지정된 비활성 레버를 눌러도 프로그래밍된 효과가 없습니다. 쥐가 연속 3 일 동안 하루에 적어도 8 회 주입을 성공적으로 얻을 때까지 적어도 10 일 동안자가 투여 실험을 계속하십시오.
20일까지 획득 기준에 도달하지 못하면 연구에서 제외됩니다. 획득 기준이 성공적으로 충족되면 쥐가 조작 챔버에서 자유롭게 프레스를 사용할 수 있도록 하여 6일에서 10일 동안 쥐에게 1시간의 도구 멸종 세션을 실시합니다. 연속 이틀 동안 평균 최대 25 개의 레버 프레스가 발생할 때까지 매일 기기 소멸을 계속하십시오.
장기 우울증 또는 LTD의 광유전학적 유도의 경우 깨끗한 표준 설치류 하우징 케이지 위에 매달린 회전 조인트를 통해 패치 케이블을 473나노미터 청색 레이저 다이오드에 연결합니다. 작동 지침에 따라 레이저를 켜고 레이저를 펄스 발생기에 연결하십시오. 쥐에게 1 헤르츠에서 2 마이크로 초의 900 펄스의 빛을 제공하도록 설정을 조정하십시오.
광 센서를 사용하여 패치 코드를 통한 광 출력을 측정하고 패치 케이블을 통한 광 출력이 약 5-7밀리와트가 되도록 레이저 강도를 조정합니다. 쥐를 깨끗한 하우징 케이지에 넣고 페룰을 노출시키는 먼지 덮개와 페룰 슬리브를 제거합니다. 그런 다음 패치 코드를 각 페룰에 양측으로 연결합니다.
제대로 설정되면 설치류는 광유전 자극 중에 케이지 주위를 자유롭게 움직일 수 있습니다. 쥐가 3 분 동안 환경을 탐험하도록 허용 한 후 펄스 발생기를 켜서 광유전 자극을 시작하십시오. 장기 우울증 유도 후, 쥐를 3 분 동안 새장에 머물게했다가 다시 케이지에 넣습니다.
생체 내 광유전학적 자극 24시간 후, 쥐를 조작적 컨디셔닝 챔버에 다시 넣고 코카인 추구 행동을 평가하기 위해 1시간 표준 큐 유도 복원 세션을 거칩니다. 활성 레버를 누르면 빛과 톤 큐가 10초 동안 표시됩니다. 첫 번째 검사 후 최소 일주일 후에 두 번째 복원 검사를 실시하여 광유전학 LTD 유도가 코카인 탐색을 장기간 억제하는지 확인하십시오.
대표적인 분석에서, 코카인자가 투여의 획득 및 멸종이 보여진다. 코카인 주입과 능동 레버 반응은 획득 전반에 걸쳐 증가했으며 비활성 레버 반응은 거의 없었습니다. 코카인자가 투여 기간 동안, 활성 반응의 수는 두 번째 주 동안 안정화되기 전에 각 획득 일에 걸쳐 점차적으로 증가했습니다.
멸종 첫날, 레버 프레스의 초기 부스트가 관찰된 후 두 레버의 반응이 감소했습니다. 도구 적 멸종 이후, 단서의 재 도입은 적극적인 레버 반응의 수의 증가로 대표되는 코카인 탐색을 복원했습니다. Optical LTD는 컨트롤에 비해 액티브 레버 프레스를 크게 줄였습니다.
7일 후, 랫트를 다시 시험하였다. 이전에 MGN-LA LTD를받은 동물은 대조군에 비해 능동적 레버 프레스가 현저히 감소하여 광학 LTD가 코카인 탐색을 장기간 감소 시켰음을 보여주었습니다. 생체 외 전기 생리 학적 기록은 광학 LTD에 이어 LA 뉴런에서 광학적으로 유발 된 흥분성 시냅스 후 전류의 진폭의 감소를 보였다.
또한, 흥분성 시냅스 후 전위의 상승 기울기는 가짜 자극을 받은 동물에서 뉴런의 생체 외 광학 자극에 의해 감소되었지만 생체 내 광학 LTD를 가진 동물의 뉴런에서는 감소하지 않았습니다. 광섬유 임플란트의 배치 및 바이러스 발현은 측면 편도체 및 MGN에서 조직학적으로 확인되었다. 코카인 추구 행동을 성공적으로 줄이려면 광섬유 임플란트를 통해 적절한 광 출력을 얻고 지속적인 저주파 자극을 사용하여 장기적인 우울증을 촉진하는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라 신경 기록 기술을 사용하여 신경 활동의 변화를 결정할 수 있으며 코카인 추구 또는 기타 학습 된 행동에 대한 다른 행동 테스트를 수행 할 수 있습니다.
