재조합 팔다리는 생체 내 환경에서 배아 신호의 영향 하에서 세포 분화 및 동력 형성 과정에서 연구를 위한 강력한 모델이다. 이 분석은 닭 사지 발달 생물학에 국한되지 않고 잠재적 인 적용을 허용하는 여러 변형을 허용합니다. 그것은 다른 줄기 또는 다른 유기체로부터의 선조에 적용될 수 있다.
시작하려면 사흘 반 후에 인큐베이터에서 알을 제거하고 70 % 에탄올로 면봉 한 다음 공기 건조에 두십시오. 다음으로, 난자를 캔들링하고 혈관을 관찰하여 발달중인 배아를 확인하고 찾습니다. 배아가없는 난자는 버리십시오.
한 쌍의 무딘 포셉 끝이있는 달걀 껍질의 무딘 끝을 탭하여 창을 열고 포셉을 사용하여 껍질의 약 한 평방 센티미터를 제거하십시오. 그런 다음 계란을 플라스틱 또는 판지 홀더로 옮기십시오. 계란을 입체 현미경 아래에 하나씩 놓습니다.
공기 막을 확인하고 용기가없는 지역의 작은 구멍을 선택하여 제거하십시오. 미세한 외과 용 포셉의 도움으로이 부위를 꺼내고 배아와 접촉하는 달걀 껍질 조각을 제거하십시오. 미세한 수술 포셉으로 양수 낭을 찢어 버립니다.
무딘 포셉으로 계란에서 배아를 조심스럽게 제거하고 얼음처럼 차가운 1x PBS가 들어있는 멸균 페트리 접시에 옮깁니다. 배아를 빙냉 1x PBS로 1회 세척하고 입체현미경으로 남아있는 막을 회수한다. 그런 다음 뒷다리 새싹을 찾으십시오.
각 뒷다리 새싹을 세로로 자르고 미세한 수술 포셉으로 배아 측면에 매우 가깝게 자릅니다. 배아를 1x PBS로 유지한다. 그런 다음 사지 새싹을 플라스틱 이송 피펫이있는 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다.
다음으로, PBS를 500 마이크로리터의 0.5% 트립신 용액으로 교체한다. 사지 새싹을 섭씨 37도에서 7 분 동안 온도 차단에 배양하십시오. 그런 다음 트립신 용액을 HBSS에서 밀리리터 콜라게나제 유형 네 개당 두 밀리그램의 500 마이크로리터로 교체하고 또 다른 8분 동안 써모블록에서 인큐베이션한다.
가능한 한 많은 콜라게나제를 제거하고 효소를 불활성화시키기 위해 10 % FBS가있는 차가운 고 포도당 DMEM 1 밀리리터로 대체하십시오. 혼합물을 약 10 배 부드럽게 피펫하십시오. 세포를 포함하는 현탁액을 70 마이크로미터 세포 스트레이너로 여과하여 외배엽을 남긴다.
현탁액을 다시 약 5 내지 10회 정도 피펫하고, 실온에서 5분 동안 200배 g에서 원심분리한다. 그런 다음 상청액을 버리십시오. 과량의 콜라게나제를 한 밀리리터의 배지로 세척한 다음, 현탁액을 원심분리하고 배지를 조심스럽게 버린다.
다음으로, 세포를 방해하지 않고 1.5 밀리리터의 배지를 첨가하고 온도 블록에서 섭씨 37도에서 1 ~ 1.5 시간 동안 배양하여 세포가 컴팩트 한 펠렛을 형성 할 수있게하십시오. 뒷다리 새싹을 얻은 후 플라스틱 피펫이있는 빈 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 과량의 1x PBS를 제거하고 멸균 1x PBS에서 0.5 % 트립신 500 마이크로 리터로 교체하십시오.
혼합물을 섭씨 37도에서 30분 동안 열블록으로 인큐베이션한다. 사지 새싹이있는 트립신 용액을 멸균 된 페트리 접시에 옮기십시오. 그런 다음 가능한 한 많은 양의 과도한 트립신을 제거하고 모든 사지 새싹이 덮일 때까지 얼음처럼 차가운 1x PBS로 페트리 접시에 10 % FBS를 넘깁니다.
입체 현미경으로 사지 새싹을 확인하십시오. 다음으로, 외배엽을 사지 중배엽 세포로부터 약간 분리된 투명한 막으로 확인한다. 미세한 수술 포셉으로 사지 새싹의 가장 근위 끝을 유지하는 포셉으로 외배엽을 분리하고 분리하십시오.
이전 단계에서 중배엽 펠렛을 가져 와서 약 600 마이크로 리터의 배지를 버리십시오. 그런 다음 조심스럽게 피펫 팁으로 펠렛을 부수지 않고 분리하십시오. 튜브를 거꾸로 뒤집어 펠릿을 빈 외배엽이 들어있는 페트리 접시로 옮깁니다.
한 쌍의 미세 수술 포셉으로 펠릿의 작은 조각을 자르고 가능한 한 외배엽에 가깝게 놓습니다. 외과 용 포셉으로 외배엽을 열고 펠렛을 가능한 한 단단히 외피 홀에 넣으십시오. 앞다리 근처의 양수 낭을 열어 배아의 오른쪽 측면을 노출시킵니다.
앞다리 위치에 따라 텅스텐 바늘로 상처를 긁어 두세 개의 소미트 길이로 긁어 내고 출혈이 생길 때까지 중배엽을 약간 손상시킵니다. 재조합 팔다리를 병아리 배아로 개별적으로 옮기고 소마이트 상처 위에 그 기초를 놓습니다. 팔라듐 와이어 두 조각으로 재조합 사지를 올바르게 고정하십시오.
재조합 사지의 기저부를 상처와 정렬하십시오. 테이프로 창을 봉인하고 계란을 인큐베이터로 되돌립니다. 성공적인 이식에서, 재조합 사지는 공여체 배아의 중배엽 벽에 단단히 부착된 돌출부로서 관찰되었다.
반대로, 재조합 사지는 중배엽 벽으로부터 분리되거나 세포 생존성 또는 이식편이 실패했을 때 거친 형태학을 제시하였다. 알시안 블루 염색은 육일 닭, 닭 재조합 사지에서 골격 요소를 입증했다. 알시안 블루를 클리어하기 전에, 에탄올 중의 이미지들이 형태학적 및 정량적 측정을 위해 얻어졌다.
H&E 염색 또는 염색되지 않은 팔다리를 슬라이스하여 조직 및 세포를 관찰하였다. 이 기술은 생체 내에서 사지 오가노이드를 개발하고 다른 공급원 또는 종의 줄기 세포를 사용하여 세포 분화 또는 형태 형성 과정을 연구 할 수 있습니다.
