이 비디오를 Hi.In 관류된 마우스 심장의 과분극 MR 연구를 수행하는 방법을 배우게 됩니다. 연구실의 MD/PhD 학생인 David Shaul이 다양한 기술과 절차를 안내합니다. 오늘 우리는 31P NMR 분광법과 결합된 과분극 탄소-13 피루브산 대사를 연구하기 위한 프로토콜을 배웁니다.
피루브산 대사는 호기성 대사와 혐기성 대사의 교차로에 있습니다. 따라서 심장의 다양한 상태를 연구하는 데 큰 가치가 있습니다. 자, 시작하겠습니다.
마우스 심장은 10mm NMR 튜브 내에서 Krebs-Hensleit 버퍼로 분리되고 관류됩니다. 그런 다음 심장을 NMR 분광계에 삽입합니다. 거기에서 31P 스펙트럼이 기록되어 아데노신 삼인산, 인산 및 무기 인산염의 공명을 관찰하여 심장 에너지 및 pH를 관찰합니다.
한편, 첫 번째 위치에서 탄소 -13으로 표지 된 피루브산 샘플은 과분극됩니다. 그리고 용해가 발생한 후 심장에 주입하여 젖산, 무기물 및 피루브산을 실시간으로 조직화된 활동을 측정할 수 있습니다. 실험 하루 전에 400 밀리리터의 변형 된 Krebs-Henseleit 완충액을 준비하십시오.
첫 번째 단계로, 우리는 이중 증류수에서 이러한 성분을 해결합니다. 그런 다음 이 용액을 이 산소 혼합물로 20분 동안 거품을 낸 다음 염화칼슘을 첨가합니다. pH를 7.4로 조정합니다.
실험 당일에 포도당과 인슐린을 첨가하십시오. 수조를 섭씨 40도로 설정합니다. 200 밀리리터의 KH 버퍼가있는 중간 병을 욕조에 넣습니다.
연동 펌프를 사용하여 KH 버퍼를 재활용하십시오. 하나의 유입 라인과 두 개의 유출 라인을 연결하십시오. 가열된 KH 버퍼에 유입 및 유출 라인을 삽입합니다.
95% O2 및 5% CO2의 산소 혼합기를 사용하십시오. 그런 다음 가열된 KH 버퍼에 산소 라인을 삽입합니다. 연동 펌프를 켜고 분당 7.5밀리리터의 일정한 유량 무게로 조정합니다.
심장을 도입하기 전에 시스템을 보정하고 싶습니다. 따라서 유입 및 유출 라인을 10mm NMR 튜브에 삽입하고 NMR과 호환되는 광학 온도 프로브를 삽입합니다. NMR 튜브를 자석 구멍에 삽입합니다.
가열 탱크를 섭씨 42도로 조정하고 NMR 가열을 사용하여 자석 내부 온도를 섭씨 37도로 조정합니다. NMR 온도는 NMR 호환 온도 코어를 사용하여 자석 내부의 KH 버퍼에서 실제로 모니터링됩니다. 이제 31P 분광법을 사용하여 완충액 내부의 무기 인산염 신호를 관찰할 수 있습니다.
이것은 수술 절차에 필요한 장비입니다. 100 밀리리터의 KH 버퍼를 얼음에 넣고 동일한 산소 혼합물로 거품을 낸다. 분당 340밀리리터의 유속으로 유도를 위해 실내 공기와 혼합된 3.3% 이소플루란으로 상자 챔버 내부의 마우스를 마취합니다.
마우스를 비강 마취로 옮깁니다. 동일한 유속에서 2.9%이소플루란으로 줄입니다. 발을 꼬집어 부정적인 페달 통증 반사를 확인하고 마우스가 완전히 마취되었는지 확인합니다.
마우스에 300단위의 헤파린 나트륨을 복강 주사합니다. xiphoid 과정 아래 2 센티미터의 피부를 자릅니다. 복강을 노출시키기 위해 복벽을 자릅니다.
시저 클램프를 검상돌기와 흉부 피부 사이에 놓고 흉벽을 수축시키고 횡격막을 노출시키는 데 사용합니다. 다이어프램의 오른쪽 엽에 구멍을 뚫은 다음 나머지 다이어프램을 자릅니다. 심장 및 혈관과 같은 더 깊은 기관과의 접촉을 피하면서 흉벽 정중선을 가로질러 자릅니다.
나트륨 헤파린 200 단위를 심장의 좌심실에 주입하십시오. 심장 마비를 달성하기 위해 0.5 몰의 KCL 0.1 밀리리터를 심장에 주입하십시오. 흉선 조직을 앞쪽으로 집어넣고 뿌리에서 잘라내어 그 아래에 있는 대동맥을 노출시킵니다.
대동맥 손상을 피하면서 가능한 한 많은 흉선 조직을 제거하십시오. 정맥 카테터가 자유롭게 통과할 수 있도록 잔여 흉곽 조직을 제거합니다. 구부러진 집게를 대동맥 아래에 놓고 대동맥 주위에 실크 봉합사 매듭을 놓는 데 사용합니다.
구부러진 집게를 대동맥 뿌리에 놓고 심장을 아래쪽으로 수축시켜 대동맥을 노출시키고 늘립니다. 3 밀리리터의 얼음처럼 차가운 KH 완충액을 좌심실에 주입하여 대동맥에서 혈전을 제거하고 심장 생존력을 보존합니다. 심장 표면에도 여러 방울을 떨어뜨립니다.
정맥 카테터 바늘을 사용하여 후벽을 손상시키지 않고 대동맥의 동맥 벽을 뚫습니다. 그런 다음 바늘로 카테터를 약 3 밀리미터 삽입하십시오. 그런 다음 바늘을 제거하고 동시에 카테터 튜브를 추가로 5mm 삽입하되 좌심실로 들어가지 않도록 합니다.
시아노아크릴레이트 접착제를 대동맥의 천자 부위에 놓아 봉합사를 조이는 동안 카테터 튜브가 대동맥 밖으로 미끄러지는 것을 방지합니다. 대동맥과 캐뉼러 튜브 사이에 매듭을 부드럽게 두 번 묶습니다. 추가로 5 밀리리터의 KH 완충액을 좌심실에 주입하고 캐뉼러 삽입 튜브를 통해 흐르는지 확인하십시오.
이것은 캐뉼러가 성공했음을 나타냅니다. 대동맥 뿌리에서 구부러진 집게를 제거하십시오. 캐뉼러 제 및 심장 조직과의 접촉을 피하면서 주변 내장에서 심장을 분리하십시오.
캐뉼라를 흐르는 얼음처럼 차가운 KH 버퍼 주사기에 즉시 연결하십시오. 심장에 기포가 유입되는 것을 피하는 것이 중요합니다. 비 심장 조직을 제거하십시오.
이 단계에서 심장 박동이 재개되는 것을 관찰해야합니다. 나머지 실크 봉합사 가장자리를 자릅니다. NMR 룸에서 주사기에서 캐뉼라를 분리하고 관류 시스템의 37도 KH 버퍼에 연결합니다.
그런 다음 심장을 10mm NMR 튜브에 삽입합니다. 심장을 프로브 중앙에 놓고 심장이 있는 NMR 튜브를 NMR 분광계의 구멍에 삽입합니다. 10-20Hz의 선폭에 도달할 때까지 1H 채널의 물 신호를 사용하여 shim"을 수행합니다.
그런 다음 정상 상태에서 50도의 플립 각도와 1.1초의 TR을 사용하여 심장의 31P 스펙트럼을 획득합니다. 이러한 조건은 PCr 및 무기 인산염의 신호보다 ATP 신호를 선호합니다. ATP와 PCr의 신호를 관찰한다는 것은 조직이 NMR 분광계 내에서 생존 가능하다는 것을 의미합니다.
전용 처리 프로그램을 사용하여 스펙트럼을 분석합니다. 7헤르츠의 지수 상승을 수행합니다. 기준선 보정을 사용한 다음 phosphocreatine 신호를 마이너스 2.5ppm으로 할당합니다.
무기 인산염, 인산 크레아틴 및 ATP의 신호를 관찰하십시오. 첫 번째 위치에 탄소 13으로 표지된 피루브산 샘플을 80분 동안 분극화합니다. 80분 동안 편광을 한 후 샘플을 용액으로 준비합니다.
이것이 해산이 일어나는 방식입니다. 연속 관류 접근법을 사용하여 용해 내용물을 심장에 주입합니다. 이 접근법은 조직 관류 및 산소 공급 수준에 대한 중단 없이 피루브산을 전달하도록 설계되었습니다.
과분극화된 피루브산을 포함하는 용액 매질은 원추형 튜브에 주입된 다음 바이패스에 수동으로 주입된 다음 바이패스를 통해 관류를 지시하고 바이패스 내용물이 심장을 통해 지속적으로 흐르고 결국 씻겨 나옵니다. 우리는 분당 7.5 밀리리터의 관류 속도와 22 밀리리터의 바이 패스 볼륨을 사용합니다. 그래서, 과분극 된 미디어는 약 3 분 동안 심장을 통해 흐르고 있습니다.
이 기간 동안 탄소 13 분광법을 사용하여 피루브산, 젖산염 및 중탄산염 신호를 측정합니다. 우리는 젖산 여기와 중탄산염 여기를 번갈아 가며 6초 간격으로 여기하는 여기 방식을 사용합니다. 우리는 탄소 13 신호를 획득하기 위해 포화 선택적 여기를 사용했습니다.
이 접근법에서, 기질 피루브산은 최소한으로 여기되는 반면, 대사 산물 인 젖산 및 중탄산염은 완전히 흥분된다. 약 3분 동안 탄소 13 피루브산 대사를 관찰하고 기록합니다. 대사 조사는 피루브산 신호가 붕괴된 후 완료됩니다.
이 그림은 KH 버퍼로 관류된 마우스 심장에서 기록된 31P 스펙트럼을 보여줍니다. 심장에서 획득 한 스펙트럼은 알파, 베타 및 감마 ATP, PCr 및 Pi의 신호를 보여줍니다.Pi 신호는 두 가지 주요 구성 요소로 구성되며, 왼쪽의 구성 요소는 더 높은 필드에 나타나며 주로 pH 7.4에서 KH 버퍼로 인한 Pi 신호를 나타냅니다. 아래쪽 필드에 있는 오른쪽의 경계와 덜 균질한 성분은 더 산성 환경에 있는 Pi 신호를 보여줍니다.
이 성분은 심장 조직에서 발생합니다. 다음으로, 전체 Pi 신호에서 버퍼 Pi 신호를 빼서 조직의 Pi 신호를 얻었다. 이어서, ppm 스케일에서 pH 스케일로 변환하였다.
pH는 가중 평균, 가중 중위수, 전역 최대값 및 왜도를 계산하여 조직 Pi 신호의 다중모수 분석을 사용하여 조사됩니다. 이 그림은 관류된 마우스 심장에 과분극된 탄소 13 피루브산을 주입하는 동안 과분극 생성물 선택적 포화-여기 접근법을 사용하여 얻은 일반적인 탄소 13 NMR 스펙트럼을 보여줍니다. 젖산, 피루브산 및 중탄산염 신호에 주목하십시오.
피루브산 신호는 표시된 목적을 위해 여기에서 잘립니다. 기질과 대사 산물의 신호 강도의 변화는 T1 이완, 여기 주파수 및 흐름 특성에 기인합니다. 다음으로, 이러한 신호의 적분 강도가 플로팅됩니다.
또한, 우리는 32초의 유효 붕괴 시간 상수를 사용하여 T1 붕괴 및 4D 주파수 여기의 효과에 대해 수집된 피루브산 적분 강도를 검은색 원으로 표시했습니다. 이러한 보정은 기판에 대한 예상된 유동 역학을 산출하는 것으로 밝혀졌다. 세척, 고원 및 세척.
이 보정된 신호 시간 코스를 사용하여 추가 분석을 위해 NMR 튜브의 피루브산 농도가 일정하고 최대인 연한 파란색으로 강조 표시된 시간 창을 선택했습니다. 선택된 시점들 각각에 대해 LDH 및 PDH의 비율을 계산한 다음, 평균화하였다. 이 주입의 주요 값은 초당 나노몰 단위로 제공됩니다.
요약하면, 우리는 관류된 마우스 심장에서 과분극화된 피루브산 대사 연구를 수행하기 위한 실험 시스템을 보여주었습니다. 이 정보가 도움이 되었기를 바랍니다.
