이 프로토콜의 전반적인 목표는 적색 지방 조직을 분리하고 특성화하고, 건조 된 중간엽 줄기 세포를 간단한 방법을 사용하여 인슐린 생산 세포로 분화시키는 것입니다. 중간엽 줄기 세포는 유전학 분야에서 방법을 발견했습니다. 그들은 골수, 지방 조직 및 주산기 조직과 같은 다양한 출처에서 분리 될 수 있습니다.
그들은 우수한 문화적 특성을 받아들입니다. 그들은 다 강력하며 잠재적으로 다양한 질병을 치료할 수 있습니다. 지방 조직은 중간엽 줄기 세포의 풍부한 공급원을 제공합니다.
이러한 지방 MSCs는 골수와 같은 다른 공급원에 비해 높은 수율로 리포 흡인물로부터 쉽게 분리될 수 있다. 그리고 그들은 자가 이식과 동종 이식 모두에 대한 좋은 소스를 제공 할 수 있습니다. 이 비디오에서는 쥐 부고환 지방으로부터 지방 중간엽 줄기 세포의 분리 및 특성화를위한 간단한 프로토콜을 제시합니다.
이 절차는 격리를위한 간단한 매우 효율적인 방법입니다. 분리 후, 우리는 간단하고 비교적 짧은 프로토콜을 사용하여 이러한 지방 중간엽 줄기 세포를 인슐린 생산 세포로 분화시키는 것을 견딜 것입니다. 우리는 더 강한 혈관 분획을 얻기 위해 부고환 지방의 콜라겐 소화에 의한 지방 중간엽 줄기 세포의 분리로 시작할 것입니다.
그 다음 중간엽 줄기 세포는 그들의 플라스틱 부착뿐만 아니라 CD 마커의 발현 및 다중 중배엽 혈통으로의 분화를 특징으로 할 것이다. 동물을 마취 한 다음 자궁 경부 탈구를 사용하여 안락사하십시오. 70 % 에탄올로 몸 전체에 뿌리고 복부 아래 부분의 피부와 근육을 절제하는 것으로 시작하십시오.
그런 다음 부고환 지방으로 고환을 노출시킵니다. 부고환 지방을 부드럽게 자릅니다. 지방으로 혈관을 자르지 않도록주의하십시오.
바이오 안전 캐비닛에서 포셉과 메스를 사용하여 지방 조직을 작은 조각으로 자릅니다. 지방 조직을 10 밀리리터의 멸균 PBS를 함유하는 원심분리 튜브 내로 옮긴다. 팔콘 튜브를 45 초 동안 기울여 세탁을 시작하십시오.
그런 다음 튜브를 다섯 분 동안 서 두어 두 층으로 분리하십시오. 10 밀리리터 주사기를 사용하여 주입된 PBS를 제거한다. PBS가 명확해질 때까지 이 세척 단계를 네 번에서 다섯 번 반복하십시오.
세척 후, 지방 조직을 콜라겐 용액에 재현탁시킨 다음, 조직이 거의 균질해질 때까지 진탕 수조에서 인큐베이션한다. 그 후, 조직 콜라겐 혼합물을 15초 동안 와류시킨 다음, 이후 5분 동안 원심분리한다. 원심 분리 후, 당신은 세 개의 층을 갖게됩니다.
기질 혈관 분획 위에 상층액을 조심스럽게 버리십시오. 먼저 상단의 오일층을 조심스럽게 버리고, 이어서 기질 혈관 분획 펠릿을 방해하지 않고 에코층을 버린다. 기질 혈관 분획을 멸균 BSA에 재현탁시키고 다섯 분 동안 다시 원심분리한다.
전체 원심분리, 완전한 DMEM F-12 배지를 25 센티미터 평방 플라스크에 넣으십시오. 원심분리 후, 상층액을 버리고 기질 혈관 펠릿을 완전한 DMEM F-12 배지에 재현탁시킨다. 배양 플라스크로 옮긴다.
37도 5 % 이산화탄소 인큐베이터에 두십시오. 다음 날, 부착되지 않은 세포를 제거하고 배지를 새로운 배지로 교체하십시오. 격리 다음 날부터 섬유아세포와 같은 세포가 나타나기 시작합니다.
그런 다음 시간이 지남에 따라 점차적으로 숫자와 크기가 증가합니다. 통과에 의해, 세포는 더욱 균질해질 것이다. 이들 세포는 모든 중간엽 줄기 세포 특성화 기준을 나타낸다.
이들 세포는 니코틴아미드 베타 머캅토에탄올 및 엑센딘-4를 함유하는 이 간단한 프로토콜을 사용하여 인슐린 생산 세포로 분화되었다. 분화 단계 전반에 걸쳐, 세포는 섬유아세포 형태를 잃기 시작하고, 나는 형태학처럼 군집을 생각한다. 인슐린 생산 세포가 양성 진홍색 디시톤 염색을 보이면 인슐린 생산 세포가 Pdx-1, mafA 및 인슐린과 같은 다양한 베타 세포 마커를 발현합니다.
또한, 유도된 인슐린 생성 세포는 더 높은 글루코스 농도로 도전받을 때 상청액에서 더 높은 수준의 인슐린을 분비한다. 우리는 지방 중간엽 줄기 세포의 분리 및 특성화를위한 상세하고 단계적인 프로토콜을 제공했습니다. 우리는 또한 지방 중간엽 줄기 세포를 인슐린 생산 세포로 분화시키기위한 비교적 짧고 간단하며 효율적인 프로토콜을 제공합니다.
이것은 연구자가 중간엽 줄기 세포 분야에 진입하여 인슐린 생산 세포로의 분화를 연구 할 수있는 관문을 제공합니다.
