단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 사용자 친화적이고 높은 처리량 및 완전 자동화된 데이터 수집 소프트웨어

자동화된 데이터 수집 소프트웨어는 생물학적 거대 분자의 구조적 특성화를 위해 엄청난 양의 극저온 데이터를 수집하는 데 매우 필요합니다. 자동화된 데이터 수집 소프트웨어 패키지는 병원균 생물학과 직접 연관되는 다양한 생물학적 거대 분자의 구조를 특성화하기 위해 여기에 사용되었습니다. 예를 들어, 진균, HIV 및 SASCO 2.

시작 메뉴에서 DigitalMicrograph를 클릭하여 Latitude-S 자동 데이터 수집 소프트웨어를 시작하십시오. 그런 다음 기술 관리자를 선택한 다음 단일 파티클 자동 데이터 수집을 위한 위도-S 아이콘을 선택합니다. 이전 세션 설정을 기반으로 세션을 만들려면 팔레트의 이전 세션 확인란을 기반으로 선택한 다음 새 단추를 선택하거나 기존 세션을 계속하려면 계속 단추를 누릅니다.

완전히 새 세션을 시작하려면 팔레트의 새 탭을 클릭합니다. 계속할 세션이 포함된 폴더를 선택하고 데이터를 저장하도록 폴더를 선택합니다. 그런 다음 설정 아이콘을 클릭하고 관리되는 상태 탐색 상자에서 상태를 추가하고 TEM 상태, 카메라 상태 및 이미지 또는 스톡 옵션을 설정합니다.

그런 다음 상태 이름을 지정하거나 상태 설정 요약을 열어 저장 설정을 엽니다. 다음으로, 아틀라스 상태 팔레트를 클릭하여 아틀라스 상태를 구성하고 배율, 조명 조건 및 카메라 노출 시간에 대한 매개 변수를 설정하고 다음 상태로 이동하려면 다음 상태로 이동하려면 다음 상태를 클릭합니다. 그런 다음 그리드 상태 팔레트를 클릭하여 그리드 상태를 구성하고 현미경 이미징 광학, 조명 조건 및 카메라 노출 시간을 위한 매개 변수를 설정하고 다음을 클릭합니다.

구멍 팔레트를 클릭하여 구멍 상태를 구성하고 이미징 광학, 조명 조건, 비닝 및 카메라 노출 시간 매개 변수를 설정합니다. 다음을 클릭한 후 포커스 팔레트를 클릭하여 다음 초점 상태를 구성하고 이미징 광학, 조명 조건, 비닝 및 카메라 노출 시간에 대한 현미경 설정을 설정합니다. 그런 다음 구멍 근처의 비정질 탄소 영역에 초점을 맞추고 다음 상태로 이동하려면 다음 상태를 클릭합니다.

데이터 팔레트를 클릭하여 데이터 상태를 구성하고 현미경 설정에 대한 매개 변수를 설정한 다음 다음을 클릭합니다. 지정된 탭의 디포커스 값 범위와 단계 크기를 지정하는 포커스 구성 팔레트를 클릭하고 다음 단추를 눌러 다음 단계로 이동합니다. 그리드에 필요한 기능에 초점을 맞추고 캡처 버튼을 클릭합니다.

그런 다음 다른 상태의 각 이미지에 동일한 피쳐에 빨간색 크로스 마크를 배치합니다. 뷰 필드가 아틀라스 및 그리드 상태보다 크기 때문에 포커스, 데이터 및 구멍 상태로 시작합니다. 다음으로, 아틀라스와 그리드 상태를 확대하여 동일한 피쳐에 적색 크로스 마크를 배치합니다.

5개 상태 간의 위치 및 오프셋을 계산하고 출력 창에 위치와 오프셋을 반영하려면 계산 단추를 클릭합니다. 캡처 팔레트를 클릭하고 요구 사항에 따라 그리드의 전체 그리드 또는 일부를 커버하는 아틀라스의 크기를 선택합니다. 아틀라스를 캡처하려면 아틀라스를 탐색하고 얼음 두께에 따라 그리드 사각형을 선택합니다.

원하는 그리드 사각형을 선택하면 일정 단추를 클릭하고 각 그리드 사각형이 캡처될 때 그리드 사각형 채우기의 타일을 관찰합니다. 일정 단추를 클릭하면 구멍의 위치를 추가하여 그리드 사각형의 대표 구멍을 선택합니다. 구멍 이미지를 획득하면 데이터 및 포커스 위치를 정의하고 레이아웃을 템플릿으로 저장합니다.

자동 찾기를 클릭하고 구멍 크기를 입력하고 프로그램의 찾기 버튼을 클릭하여 직경에 따라 구멍을 자동으로 찾습니다. 그리드 사각형 및 얼음 오염에서 구멍을 제거하기 위해 강도를 설정합니다. 자동 찾기를 통해 선택한 노란색 표시 도구를 추가한 후 위도 작업의 일정 단추를 클릭합니다.

cisTEM 소프트웨어를 사용하여 모션 보정 된 현미경 그래프의 초기 수동 스크리닝에 따라 대부분의 데이터가 원하는 신호 범위 내에 있는 것으로 나타났습니다. 또한 디포커스 범위에서 수집된 이미지도 cisTEM에서 수동으로 검사했습니다. 스파이크 입자는 구조 시각화를 위한 2D 클래스 평균을 계산하기 위해 수동으로 선택되었지만 각각의 데이터 세트를 사용하여 고해상도 구조 특성화가 가능했습니다.

3D 분류는 스파이크 단백질이 공개 확인및 아래로 가까운 확인에 있는 1RBD가 있다는 것을 표시했습니다. 스파이크 단백질의 1RBD 오픈 확인은 C1 대칭을 사용하여 재구성되었습니다. 스파이크 단백질 맵은 측면 상단 및 하단 뷰에 표시됩니다.

EM 맵에는 측면 체인의 더 나은 시각화를 위한 원자 구조가 장착되어 있습니다. RBD 다운 클로즈마크는 C3 대칭과 스파이크 3D 정제 모델 및 EM 맵으로 정제되었으며, 표시된 대로 원자 구조가 장착되어 있습니다. S2 서브 도메인으로 확인된 스파이크 단백질의 중간 확인은 개별 아미노산 잔류물의 측면 사슬을 나타냈다.

결과는 위도-S가 생물학 거대 분자의 고해상도 극저온 EM 데이터를 수집할 수 있다는 것을 건의했습니다. 이 자동화된 데이터 수집 소프트웨어는 다른 전자 현미경 시스템에 사용하여 데이터를 자동으로 수집할 수 있습니다.