치료 항 타우 항체가 알츠하이머 병의 병리학을 감소시키는 제안 된 메커니즘 중 하나는 microglia에 의해 병리학적으로 집계 된 전 타우의 정리에 대한 섭취입니다. 여기서, 우리는 microglia에 의하여 타우 섭정을 평가하기 위하여 세포 기지 분석체를 제시합니다. 이 분석은 항타우 항체의 작용 메커니즘을 더 잘 특성화하는 유용한 조사 도구를 나타낸다.
실험 첫날에는 BV-2 세포를 배양한 플라스크에서 1x PBS로 먼저 세척하여 준비합니다. 그런 다음 05%의 트립신 EDTA를 섭씨 37도, 5%C02로 배양하여 플라스크에서 분리합니다. 3~5회 위아래로 배관하여 배양 배지에서 세포를 다시 중단한다.
셀을 카운트하고 밀리리터 헤파린 당 200 마이크로그램을 함유하는 배양 배지에서 밀리리터당 100, 000 세포의 최종 농도로 세포 현탁액을 준비한다. 96 개의 잘 조직 배양 플랫 하단 플레이트에 잘 당250 마이크로 리터를 추가하십시오. 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 5%C02로 플레이트를 배양합니다.
이전에 준비된 pH 염료-타우 응집체를 얼음에 해동한 후, 혈청 프리 배지의 조건당 65마이크로리터로 희석하여 500 나노몰라 용액을 만듭니다. 원하는 농도의 두 배를 달성하기 위해 혈청 프리 배지의 65 마이크로 리터에서 항체를 희석. pH 염료-타우 골재 및 항체를 96웰 U-바닥 플레이트에 혼합한다.
이 희석 판을 밀봉하고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날에는 BV-2 셀을 가진 96 웰 플레이트에서 배지를 제거한다. 실온 1x PBS의 100 마이크로리터로 각 우물의 세포를 씻으시다.
BV-2 세포판에서 PBS를 제거합니다. 다중 채널 파이펫을 사용하여 희석 플레이트에서 96웰 BV-2 셀 플레이트의 각 웰으로 125 마이크로리터를 전송하고 5%CO2로 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후 세포로부터 아미노 복합체를 제거하고 실온 1x PBS의 100 마이크로리터로 각각 의 세포를 잘 씻는다.
1x PBS를 제거한 후 25%의 트립신 EDTA의 50마이크로리터를 추가하고 5%CO2로 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다. 그 후, 배양 매체의 200 마이크로 리터를 추가하고 세포를 분리하기 위해 위아래로 파이프하여 우물을 다시 중단합니다. 세포를 96개의 U-바닥 플레이트로 옮기고 원심분리기는 섭씨 4도에서 5분간 400 x g로 전달합니다.
접시를 얼음 위에 놓고 매체를 제거합니다. 150 마이크로리터의 얼음 차가운 1x PBS 및 원심분리기를 섭씨 4도에서 5분간 400g에 다시 넣습니다. 이전에 추가된 1x PBS를 제거하고 150 마이크로리터의 얼음 차가운 PBS를 추가하여 다시 씻어 주세요.
같은 조건에서 다시 원심 분리기. 이전에 추가된 PBS를 제거하고 우물당 150개의 마이크로리터 FACS 버퍼를 추가하여 접시를 얼음 위에 놓고 세포를 세척합니다. 섭씨 4도에서 5분간 400g으로 다시 원심분리기.
접시를 얼음 위에 놓고 이전에 추가된 FACS 버퍼를 제거하고 우물당 200마이크로리터 FACS 버퍼에서 세포를 다시 중단합니다. 즉시 FACS에 의해 분석을 진행하여 라이브 셀 게이트에서 20, 000 이벤트를 획득합니다. FACS 분석의 경우 전방 산란 영역 또는 FSCA 대 측면 산란 영역 또는 SSCA 밀도 플롯을 사용하여 이물질 및 죽은 세포와 같은 낮은 전방 산란 수준이 있는 이벤트를 제외하여 라이브 셀에 게이트를 사용합니다.
그런 다음 라이브 셀 인구 내에서 FSCA를 사용하여 전방 산란 높이 또는 FSCH를 사용하여 단일 게이트를 만들고 셀 더블및 집계를 제외합니다. 그런 다음 단일 게이트의 이벤트를 사용하여 pH 염료 단일 매개 변수 히스토그램을 생성합니다. 생성된 히스토그램을 사용하여 먼저 평균 형광 강도를 결정합니다.
그 후 BV-2의 유일한 대조군을 사용하여 결정된 음성 세포를 제외하여 pH 염료-타우 양성 세포의 백분율을 결정한다. CBTau-28.1 항체는 혈류 세포측정에 의해 도시된 바와 같이 용량 의존적인 방식으로 BV-2 세포에서 타우의 섭취를 촉진한다. 높은 친화도 이중 돌연변이 CBTau-28.1 항체는 BV-2 세포에서 타우 섭취량을 야생형 항체보다 더 높은 정도로 중재하였다.
CBTau-28.1 팹 단편은 FC 수용체 중재 내화 메커니즘을 나타내는 기저 타우 섭취량을 증가시키지 않았다. 공초점 현미경 검사는 타우 섭취량의 항체 중재 증가를 확인했습니다. 녹색 pH 염료 라벨 타우 응집체는 종종 리소트래커 붉은 염료 스테인드 산성 세포기관과 공동 국화되어 내침엽 구획에서 타우 골재의 존재를 암시합니다.
CBTau-28.1 팹 파편은 타우 의 섭취량을 다시 증가시키지 않았으며, 이는 실제로 FC가 중재되었음을 나타냅니다. 우리가 방금 설명한 분석법은 microglia에 의해 타우 섭취를 중재한 항체를 구체적으로 일관되게 정량화할 수 있게 해줍니다. 이 분석기로 생성된 데이터는 항타우 항체의 작용 메커니즘을 해명하여 잠재적인 AD 치료로서 그들의 발달에 더 나아가항타우 항체를 발전시키는 유용한 도구를 나타내는 데 도움이 될 수 있다.
