Borreliella burgdorferi의 시험관 내 전사 분석 시스템은 연구자가 RNA 중합효소의 효소 활성을 제어하는 유전자 조절 메커니즘 및 인자를 연구할 수 있는 생화학적 도구를 제공합니다. 이 시스템을 통해 전사 인자, 보조 인자, 염 농도 및 pH가 Borreliella burgdorferi RNA 중합효소 기능에 어떤 영향을 미치는지 테스트할 수 있으며, 이는 유전자 조절 메커니즘에 대한 전반적인 이해에 기여합니다. 이 강력한 기술을 통해 RNA 중합효소를 선택적으로 억제하는 약물을 스크리닝할 수 있어 라임 보렐리아증을 치료하기 위한 새로운 약물 개발의 문을 열 수 있습니다.
시작하기 위해, 미세 호기성 환경에서 BSKII 배지에서 배양 된 Borreliella burgdorferi RpoC-His10X의 2-4 리터에서 밀리 리터당 10 일정의 밀도로 2-4 리터의 세포 펠릿을 수집합니다. 500 밀리리터 원심 병에서 섭씨 4도에서 30 분 동안 10, 000 배 G에서 세포를 펠렛으로 만들고 상청액을 버린다. 이어서, 세포를 30 밀리리터의 빙냉 HN 완충액에 재현탁시키고, 원심분리 단계를 반복하고, 상청액을 경사 조절한다.
작업하는 동안 세포, 용해물 및 정제된 단백질을 섭씨 4도 또는 얼지 않는 한 얼음 위에 유지하십시오. 사용된 모든 완충액에 2밀리몰 농도로 새로 제조된 디티오트레이톨을 첨가하여 RNA 중합효소를 환원 환경에 유지하고 pH 8.0을 유지합니다. 상업용 박테리아 용해 키트를 사용하여 Borreliella burgdorferi 세포 펠릿에서 용해물을 준비합니다.
프로테아제 억제제 없이 10 내지 15 밀리리터의 B-PER 용액에 펠릿을 재현탁시키고 용해가 얼음 상에서 5분 동안 진행되도록 한다. 용해 용액에 프로테아제 억제제 칵테일을 첨가하고 3 라운드의 초음파 처리를 진행하십시오. 이제 50 밀리리터 원심 분리 튜브를 사용하여 원심 분리 및 여과로 세포 용해물을 정화합니다.
코발트 컬럼 로딩 버퍼를 용액에 추가하여 총 부피를 최대 30밀리리터로 만듭니다. 세포 파편을 20, 000배 G에서 30분 동안 원심분리하여 펠렛화한다. 나중에, 0.45 마이크로미터 주사기 필터를 사용하여 상청액을 여과하고, 용해물 및 코발트 컬럼 로딩 완충액을 1:10의 최종 희석 비율로 희석한다.
제조업체의 지침에 따라 코발트 또는 니켈 수지 컬럼을 사용하여 정화된 세포 용해물 상청액에 대해 친화성 크로마토그래피를 수행합니다. 분석을 위해 flow-through, wash 및 용출된 샘플을 저장합니다. 즉시 RNA 중합효소 용액 완충용액을 완충액 교환 컬럼을 사용하여 저장 완충용액과 제조사의 지시에 따라 교환한다.
이어서, RNA 중합효소를 10-킬로달톤-컷오프 원심 필터 유닛을 사용하여 밀리리터당 0.2 내지 0.4 밀리그램의 농도로 농축시킨다. 분광 광도계로 농도를 결정하고 냉동 재고를 준비합니다. PCR 튜브에 20 내지 50 마이크로리터 부피의 RNA 중합효소 동결 스톡을 분취하고, 섭씨 영하 80도에서 RNA 중합효소를 저장한다.
방사선 오염을 줄이기 위해 방사선 벤치를 포함한 작업 표면을 준비하십시오. 신선한 RNA 중합효소 및 RpoD 스톡을 얼음 상에서 해동하고, 피펫팅 전에 해동된 모든 냉동 스톡을 완전히 혼합하고, 실험 요건에 따라 방사성 동위원소 뉴클레오티드에 대한 별도의 NTP 혼합물에서 마스터 반응 혼합물을 준비한다. 실험 세트의 대조 반응을 PCR 튜브에 분주합니다.
물, 반응 혼합물, RNA 중합효소 및 RpoD를 지정된 PCR 튜브에 분배한 후 피펫팅으로 시약을 혼합합니다. 준비된 물질을 방사선 벤치로 옮기고 알파-32P 표지된 ATP를 NTP에 첨가한 후 부드러운 피펫팅으로 혼합합니다. 시험관내 전사 반응 혼합물을 함유하는 튜브에 NTP를 첨가하고, DNA 주형을 첨가하여 시험관내 전사 반응을 개시한다.
부드럽게 피펫팅하여 반응 부피를 혼합하고 튜브를 섭씨 37도에서 열순환기 또는 열 블록에서 5분 동안 배양합니다. 열순환기 또는 열 블록에서 반응을 제거하고 50% 포름아미드를 함유하는 동일한 부피의 2X RNA 로딩 염료를 반응 혼합물에 첨가하여 시험관 내 전사 반응을 중지합니다. 섭씨 65도에서 5분 동안 열순환기 또는 열 블록에서 반응을 배양하여 효소를 변성합니다.
겔 전기영동을 사용하여 시험관내 전사된 RNA를 180볼트에서 30 내지 45분 동안 10%에서 15% TBE 우레아 폴리아크릴아미드 겔로 분리합니다. 비혼입 방사성 표지된 ATP를 함유하는 겔의 임의의 부분을 제거한 후, 겔을 포스포 스크린에 밤새 노출시키고, 포스포스크린 이미저를 사용하여 방사성 표지된 RNA를 이미지화한다. SDS-PAGE는 RNA 중합효소 복합체의 3개의 펩타이드인 RpoC, RpoB, RpoA에 해당하는 3개의 밴드를 나타내었다.
MBP-태깅된 재조합 보렐리엘라 부르그도르페리 RpoD의 크기와 일치하는 115 킬로달톤의 펩티드가 또한 관찰되었다. 인자 XA 프로테아제와 단백질 혼합물의 절단은 RpoD 및 MBP의 두 가지 중요한 생성물의 생성을 유도했습니다. Borreliella burgdorferi FLGB의 프로모터 부위는 PCR에 의해 생성되었습니다.
RpoD 농도의 2배 희석은 축적된 RNA 생성물의 더 낮은 수준을 발생시킨다. RNA 중합효소 농도가 낮으면 RpoD 농도 범위에서 더 적은 수의 RNA 생성물을 얻을 수 있습니다. 밀도 측정 신호는 두 실험에서 반응에 존재하는 RpoD의 양 사이의 선형 관계를 나타냅니다.
RNA 중합효소 활성은 정제, 저장 및 실험 과정 동안 다양한 인자에 민감합니다. 좋은 계획과 함께 신선한 효소와 시약은 이 프로토콜에서 성공할 수 있는 최고의 기회를 제공합니다.
