oxphos 및 해당 과정의 실시간 생체 에너지 프로파일을 조사하는 것은 RPE 건강 및 기능을 특성화하는 핵심 요소로 부상하고 있습니다. 고분해능 호흡 측정법을 사용하면 정상 RPE와 질병 RPE의 대사 상태를 효율적으로 비교할 수 있습니다. 이 기술은 산소 소비율, OCR 및 세포외 산성화율(ECAR)의 측정을 통해 oxphos와 해당과정을 동시에 탐색할 수 있는 장점이 있습니다.
RPE 세포는 대사 활성이 높은 세포이며 AMD 동안 퇴화되는 첫 번째 세포 중 하나입니다. 그들의 대사 및 미토콘드리아 기능을 이해하면 새로운 약물 개발이 가능합니다. 시작하기 위해, 인간 RPE 배지의 세포 현탁액을 각 웰에서 100 마이크로 리터 당 20, 000 세포의 최종 농도로 웰 당 100 마이크로 리터를 첨가하십시오.
그리고 네 모서리 우물을 비워 두십시오. 균일한 세포 현탁액을 보장하기 위해 여러 번 피펫을 위아래로 피펫팅하고, 용이성과 일관성을 위해 다중 채널 피펫을 사용합니다. 배경 보정을 위해 4개의 빈 모서리 웰에만 100마이크로리터의 미디어를 추가합니다.
세포 배양 접시를 실온에서 1시간 동안 방치하면 가장자리 효과를 최소화하는 데 도움이 됩니다. 그런 다음 섭씨 5 % 이산화탄소 37 도의 인큐베이터에 넣고 가습합니다. 하룻밤 배양 후 현미경으로 세포를 검사하여 배지를 변경하기 전에 형태와 색소 침착 수준을 확인합니다.
후속 검사일에 세포가 특징적인 조약돌과 같은 형태와 합류하고 시간이 지남에 따라 색소 침착을 얻는지 확인하십시오. 분석 전날 센서 카트리지의 수화를 보장하려면 유틸리티 플레이트의 각 웰에 200마이크로리터의 탈이온수를 채우고 유틸리티 플레이트의 물에 잠긴 센서 카트리지를 놓습니다. 약 20ml의 보정 용액을 이산화탄소가 없는 섭씨 37도의 가습 오븐에 밤새 보관합니다.
고해상도 호흡기 측정 기기를 켜고 소프트웨어를 시작하여 기기가 밤새 섭씨 37도에서 안정화되도록 합니다. 분석 당일, 분석을 실행하기 최소 45분 전에 다용도판의 물을 같은 양의 따뜻한 보정 용액으로 교체하십시오. 페놀 레드가 없는 준비된 Mito 스트레스 테스트 분석 배지 25 밀리리터를 섭씨 37도까지 가온하고, 튜브 탑 필터 유닛을 사용하여 pH 7.4 조절된 배지를 진공 여과한다.
세포 배양 플레이트에서 인간 RPE 배지를 제거하고 새로 준비된 분석 배지 100마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 분석을 시작하기 전에 세포 배양 접시를 이산화탄소가 없는 섭씨 37도의 가습 오븐에 1시간 동안 넣습니다. 각 센서 카트리지에는 분석 중에 테스트 화합물을 세포 배양 플레이트 웰에 주입하기 위한 웰당 4개의 시약 전달 포트가 있습니다.
각각의 분석 배지에서 약물 스톡을 희석하여 각각 3 밀리리터의 Tenex 약물 용액을 준비합니다. 다음으로, 20 마이크로리터의 테넥스 약품 스톡을 포트 A로, 22 마이크로리터를 포트 B로, 25 마이크로리터를 포트 C로 피펫팅하여 각 웰에서 지정된 최종 약물 농도를 달성합니다. 그런 다음 분석 소프트웨어에서 템플릿 탭을 열고 Mito 스트레스 테스트를 선택하고 그룹 정의를 입력합니다.
Mito 스트레스 테스트 약물의 주입 전략에 대한 세부 정보를 입력합니다. 그런 다음 대조군 또는 치료를 위해 분석에서 다양한 실험 그룹에 대한 세부 정보를 입력합니다. 기본 분석 배지에 다양한 보충제와 특정 농도를 추가하기 위해 분석 배지에 대한 세부 정보를 입력합니다.
마지막으로 셀 유형을 추가합니다. 다음 탭을 클릭한 다음 플레이트 맵을 클릭하여 검사 중인 다른 그룹을 96웰 플레이트의 특정 위치에 할당합니다. 플레이트 맵을 완료하면 프로토콜 탭을 클릭하여 기본 Mito 스트레스 테스트 프로토콜에 대한 기기 프로토콜을 검토합니다.
그런 다음 분석 실행을 클릭하고 교정을 위해 유틸리티 플레이트의 교정 용액에 담근 센서 카트리지를 삽입합니다. 이 과정은 약 25분이 소요되며 각 바이오센서는 알려진 pH 및 산소 농도의 보정 용액에서 측정된 센서 출력을 기반으로 독립적으로 보정됩니다. 보정이 완료되면 유틸리티 플레이트를 제거하고 세포 배양 플레이트를 삽입합니다.
기준선 측정 후, 기기는 Port A 약물 용액을 각 웰에 자동으로 주입하며, 각 웰은 각각 3분씩 3개의 혼합 및 측정 루프를 따릅니다. 동일한 패턴이 다른 포트에서 각각의 후속 약물 주입 후에 발생합니다. 실행이 완료되면 세포 배양 플레이트와 센서 카트리지를 제거합니다.
품질 관리를 위해 포트에 잔류 약물이 남아 있지 않은지 검사하여 모든 약물 포트와 센서 카트리지가 주입되었는지 확인하십시오. 다음으로, 현미경으로 세포 배양 마이크로플레이트의 세포를 검사하여 세포의 융합 단층을 확인합니다. 그런 다음 분석 배지를 버리고 각 웰에서 60마이크로리터의 1x 용해 완충액으로 교체합니다.
증발을 방지하기 위해 플레이트의 가장자리를 파라필름으로 감싸고 BCA 분석을 사용하여 단백질 함량을 정량화하기 전에 밤새 세포 용해를 돕기 위해 섭씨 영하 80도의 냉동고에 넣습니다. 데이터 분석에 따라 산소 소비율 또는 OCR과 세포외 산성화 속도 또는 ECAR 값을 각 웰의 단백질 마이크로그램으로 나누어 모든 데이터를 정규화합니다. 그런 다음 Excel 매크로를 사용하여 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 Mito 스트레스 테스트 매개 변수를 자동으로 계산하는 Mito 스트레스 테스트 보고서 생성기를 내 보냅니다.
Mito 스트레스 테스트에 대해 입증된 것과 동일한 단계를 수행함으로써, 표 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이 상이한 분석 배지 보충제 및 약물 주입을 제외하고 당분해 스트레스 테스트를 수행할 수 있습니다. 이 기기는 각 실행에 대해 OCR과 ECAR을 동시에 측정합니다. Mito 스트레스 테스트의 경우 주변 계산은 OCAR 판독값을 기반으로 하는 반면, 당분해 스트레스 테스트의 경우 매개변수 계산은 ECAR 판독값을 기반으로 합니다.
다음은 일차 인간 RPE 세포에 대한 Mito 스트레스 테스트를 수행하여 생성된 OCR 곡선입니다. Mito 스트레스 테스트 파라미터의 계산은 막대 그래프로 표시됩니다. 유사하게, 이것은 일차 인간 RPE 세포에 대한 당분해 스트레스 테스트를 수행하여 생성된 ECAR 곡선이며 계산은 막대 그래프로 표시됩니다.
Mito 스트레스 테스트를 위해 포트 B 약물 주입을 최적화하기 위해 1차 인간 RPE 세포에서 OCR을 증가시키는 두 가지 분리제의 효능을 비교했습니다. BAM15는 FCCP에 비해 BAM15의 훨씬 더 높은 최대 호흡 및 예비 호흡 능력에서 볼 수 있듯이 미토콘드리아 호흡 능력을 향상시키는 데 있어 FCCP보다 우수한 것으로 밝혀졌습니다. 분석을 실행하기 전날 센서 카트리지에 수분을 공급하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
이 기술을 통해 연구자들은 RPE 세포의 생체 에너지 프로파일을 더 잘 특성화하고 RPE 세포가 다양한 병원성 자극에 반응하여 대사 유연성을 나타내는 방법을 이해할 수 있습니다.
